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激光共聚焦显微镜在肿瘤研究方面的应用
发布时间:2015-10-08 14:47 作者: 阅读次数: 文章出自:

激光共聚焦显微镜在肿瘤研究方面的应用

                                                                                         李玲(华润武钢总医院病理科      430080

    摘要:激光共聚焦显微镜(LSCM)是当今世界上最先进的分子细胞生物学分析仪器。它在荧光成像基础上加装激光扫描装置,利用计算机进行图像处理,利用紫外光激发荧光探针,从而得到细胞或组织内部微细结构的荧光图像。目前在形态学、分子细胞生物学、神经科学、药理学、遗传学都有广泛地应用,在肿瘤研究中更是成为新一代强有力的研究工具。

    关键词: 激光共聚焦显微镜    肿瘤     应用

 

1.基本原理

     激光共聚焦显微镜(laser scanning confocal microscope, LSCM)利用激光扫描束经照明针孔形成点光源,对标本内平面上的每一点扫描,标本上的被照射点在探测针孔成像,由探测针孔后的光电倍增管或冷电耦合器件逐点或逐线接受,迅速在计算机监视器屏上形成荧光图像,焦平面上的点同时聚焦于照明针孔,得到的共聚焦图像是标本的横断面,此外在显微镜的载物台上加一个微量步进马达,使载物台上、下移动,最小步进距离0.1μm,这样细胞或组织各横断面的图像都能清楚地显示,实现“光学切片”的目的。

2.荧光定性、定量

普通光学显微镜及电子显微镜仅能对肿瘤抗原进行定性分析,而对多标记细胞、组织标本的抗原表达、细胞结构特征以及抗肿瘤药的作用机制等方面进行定量的观察和监测,只能借助激光共聚焦显微镜来实现。Raucher[1]在研究Skov-3HELAFaDu细胞对于热反应性ELP(由重复的VPGXG组成的弹性蛋白样多肽)的收时,以荧光标记3个细胞系中热反应性ELP,通过LSCM定量观察其吸收,发现当温度高于其转运温度时,细胞对于ELP的吸收度增加,通过调节转运阶段的环境温度来调控细胞对于ELP的吸收。

3.细胞内离子测量

    LSCM可以精确地测量细胞内Ca2+、K+、Na+、Mg2+等离子的含量。莫媛媛等[2]研究大黄素乙酰化物作用鼻咽癌CNE-1细胞后,其线粒体损伤及其与线粒体自噬的关系时,分别用5mg.L-1及10mg.L-1大黄素乙酰化物作用于CNE-1细胞,再利用激光共聚焦显微镜分别测定两组细胞中线粒体膜电位,细胞内Ca2+及线粒体自噬的活性。发现被大黄素乙酰化物作用后的细胞,细胞内游离的钙离子浓度升高,且细胞内出现酸性溶酶体增殖,其中包含线粒体探针标记的线粒体碎片等典型的自噬特征,且增加的趋势呈剂量效应关系。

4.粘附细胞的分选

细胞分选有两种方式:一种适用于数量较多细胞的分选,即在特制的培养皿上有作过荧光染色和未作荧光染色的两类细胞群,利用高能激光把染色的细胞群杀死,而保留未染色的细胞群并继续培养;另一种适用于数量较少的突变细胞,转移细胞和杂交瘤细胞,即利用高能量激光于底部带膜的特制配养皿上在欲选细胞周围切割成八角带,而非选细胞则因在该几何形状之外而去除。

5.组织光学切片及三维图像重建

共聚焦成像利用照明点与探测点共轭这一特性,可有效抑制同一焦平面上非测量点的杂散荧光及来自样品中非焦平面的荧光,因而具有深度识别能力及纵向分辨率,可看到较厚生物标本的细节,以一个微动步进马达,可逐层获得二维光学横断面图像,所以被形象的称为“显微CT”。标本的各层光学切片经计算机图像处理及三维重建软件,可以得到其三维立体结构,从而可以十分灵活直观地观察组织的立体形态和空间关系。封巍等[3]通过LSCM这一功能对转染至食管癌TE-1细胞及卵巢癌SKOV3细胞内反义VEGF寡核苷酸上荧光物质含量进行检测,并对细胞的形态进行研究,发现不同组别细胞间的形态差异具有显著诊断学意义。表明使用LSCM通过亚细胞形态学来对正常细胞和凋亡细胞作出精确诊断具可行性。Zhang[4]使用LSCM对肝癌细胞、过度增生肝细胞及正常肝细胞作光学切片和三维图像重建,对其细胞形态进行比较,发现肝癌细胞的细胞核是杂乱无章的,有异型,其染色体也是粗大不规则的,说明利用LSCM的三维图像重建技术对于癌症的诊断是十分有益的。

6.间隙链接胞间通讯

     间隙连接是动物细胞中通过连接子进行的细胞间连接。间隙连接的连接点处,双脂层并不直接相连, 而是由两个连接子对接形成通道,允许小分子的物质直接通过这种间隙通道从一个细胞流向另一个细胞。间隙连接能在细胞间形成电偶联和代谢偶联。电偶联在神经冲动信息传递过程中起重要作用。代谢偶联可使小分子代谢物和信号分子通过间隙连接形成的水性通道, 从一个细胞到另一个细胞。目前,间隙连接胞间通讯(gap iunctions intercellular communication,GJIC)与肿瘤发生之间的关系日益受到重视。Ma等[5]使用LSCM观察肝癌HHCC细胞、SMMC-7721细胞和正常肝细胞QZG中的GJIC功能。结果表明GJIC的功能在正常肝细胞中明显高于其他两组。West印迹法表明,只有QZG细胞的CX32蛋白和CX43蛋白中有未经磷酸化的酪氨酸存在,说明人类肝细胞癌的发生与CX基因的异常表达及其信号传导通路的障碍有关。

7.结语

     LSCM是一种新发展起来的检测手段,因其高分辨率,特别是对细胞内离子的定量检测,完整、清晰的细胞三维立体结构图像重建方面,是传统光镜和电镜所不能比拟的。它越来越引起医学工作者的广泛关注。近年来在肿瘤研究中得到广泛的应用。目前,LSCM与光镜、电镜、流式细胞仪相结合已成为肿瘤研究的一大趋势。

 

 

参考文献

[1] Raucher D, Chllkoti A, Enhanced uptake of a thermally responsive polypeptlde by tumor cells in response to its hyperthermla-mediated phase transition[J]. Cancer Res, 2001, 61(19):7163-7170.

[2] 莫媛媛侯华新大黄素乙酰化物致鼻咽癌CNE-1细胞线粒体自噬活性的研究[J]. 中国癌症防治杂志, 2014, 6(1): 1-3.

[3] 封巍郑晓激光共聚焦显微镜对反义VEGF寡核苷酸转染 TE-1SKOV3细胞系的光检测[J]. 肿瘤学杂志, 2011, 17(2) : 111-114.

[4] Zhang WH, zhu SN, Lu SL, et al. Three-dimensional image of hepatocellular carcinoma under confocal laser scanning microscope[J]. World J Gastroenterol, 2000,6(3): 344-347. 

[5] Ma XD, Ma X, Sui YF, et al. Signal transduction of gap junctional genes, connexin32, connexin43 in human hepatocarcinogenesis[J]. World J Gastroenterol, 2003,9(5): 946-950.  

 

 

 

 









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