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RNA干扰抑制EZH2基因表达对人胶质瘤细胞凋亡 及卡
发布时间:2015-10-08 14:47 作者: 阅读次数: 文章出自:

RNA干扰抑制EZH2基因表达对人胶质瘤细胞凋亡

及卡莫司汀敏感性的影响

周章明1 楚胜华2 

基金项目:上海交通大学医学院“新百人计划”资助项目(10XBR01)

611830 成都大学附属都江堰医疗中心神经外科(周章明);上海交通大学附属第三医院神经外科(楚胜华)               

通信作者:周章明,zhangmingzhou2010@126.com

[摘要] 目的 探讨RNA干扰技术抑制EZH2(enhancer of zeste homolog 2,EZH2)基因表达增强人胶质瘤U251细胞对化疗药物卡莫司汀敏感性及凋亡能力的研究。方法  针对EZH2 mRNA序列设计合成小干扰RNA(siRNA)的DNA模板,构建pRNAT-EZH2重组表达载体,转染人胶质瘤U251细胞;通过RT-PCR分析其对U251细胞内源性EZH2表达的影响;激光共聚焦显微镜检测U251细胞凋亡的形态学改变;用四甲基偶氮唑蓝法观察U251细胞对化疗药物卡莫司汀敏感性的改变;采用分光光度计检测Caspase活性。结果 成功构建pRNAT-EZH2重组质粒,并成功转染U251细胞;RT-PCR证实重组质粒在mRNA显著抑制EZH2基因表达(P<0.01);卡莫司汀组及卡莫司汀加pRNAT-EZH2组细胞则检测出明显的细胞凋亡;四甲基偶氮唑蓝结果证明在和卡莫司汀联合作用下,pRNAT-EZH2组U251细胞的生长抑制率明显增高(P<0.01);caspase 3 活性明显高于空白对照组和阴性对照组。结论  pRNAT-EZH2可抑制EZH2在人胶质瘤U251细胞中的表达,并增强U251细胞对卡莫司汀敏感性。

[关键词] EZH2;RNA干扰;人胶质瘤;药物敏感性;凋亡;卡莫司汀

 

Enhances gemcitabine chemosensitivity and apoptosis of human pancreatic carcinoma cells after decreasing EZH2 level by RNA interference

LI Xuefeng , PENG Hongyan, WANG Hui,et al

Department of Endocrinology, Taihe Hospital, Hubei University of Medicine, Shiyan 442000, China

 [Abstract] Objective  To explore the relationship between the expression of EZH2 and BCNU Chemosensitivity and Apoptosis of human glioma U251 cells by decreasing EZH2 gene expression by RNA interference. Methods One pair of DNA template coding siRNA was synthesized against U251 to reconstruct pRNA-EZH2, which was transfected into U251 cells. The EZH2 expression in U251 cells were transfected with pRNAT-EZH2, and it was detected by RT-PCR. MTT was used to observe the growth inhibiting ratio induced by BCNU in U251 cells. Cell apoptosis was analyzed by fluorescence microscopy. Caspase-3 activity was measured by spectrofluorometer. Results RT-PCR analyses demonstrated that pRNAT-EZH2 could significantly inhibit the expression of EZH2 in U251 cells (P<0.01); after U251 cells were exposed to BCNU, the growth inhibiting ratio, Caspase-3 activity and cell apoptosis of pRNAT-EZH2 transfected cells was significantly increased compared to that of control group and negative group (P<0.01). Conclusion  pRNAT- EZH2 could significantly inhibit the expression of EZH2, increase Chemosensitivity to BCNU and apoptosis of U251 cells.

[Key words] EZH2; RNA interference; Human glioma; Chemosensitivity; Apoptosis; BCNU

 

放化疗是目前常见的肿瘤术后治疗手段。而逃避凋亡是肿瘤发生、发展和药物抵抗的重要机制[1]。诱导肿瘤细胞凋亡并增强其对化疗药物的敏感性就成了目前在肿瘤治疗上非常重要的研究课题之一。果蝇zeste基因增强子人类同源物2(enhancer of zeste homolog 2, EZH2)是多疏基因(polycomb group genes,PcG)蛋白家族的重要成员,与肿瘤细胞凋亡并在促进癌细胞生长、侵袭、转移中起重要作用[2]。本实验通过RNAi抑制人胶质瘤细胞EZH2的表达,并检测干扰后胶质瘤细胞U251对卡莫司汀敏感性的改变,探讨EZH2对人胶质瘤细胞对卡莫司汀敏感性的影响,为人胶质瘤的治疗提供新的理论基础。

材料与方法

1. 材料

(1)人胶质瘤U251细胞购于中国科学院细胞所;放在10%新生小牛血清的RPMI-1640培养基中,内加青霉素1×105 U/ml,链霉素100mg/ml,置于5%CO2、饱和湿度、37℃恒温培养箱内培养。

(2)siRNA真核表达载体的构建:具有互补序列的能够编码短发卡RNA(shRNA)的双链寡核苷酸模板DNA由上海康成公司合成。其转录产物所形成的siRNA的作用靶点为人EZH2 mRNA。干扰序列为: AAGACTCTGAATGCAGTTGCT;在两端分别悬垂Sal I、Xba I的酶切位点,3’端酶切位点之前加入终止信号TTTT;阴性对照是双链寡核苷酸转录产物所形成的siRNA,此序列不与任何人类基因序列同源。

(3)实验分组及细胞转染:实验分为4组:空白对照组,未转染;脂质体组,转染液中仅含脂质体无siRNA;阴性对照组,转染液加入空质粒pRNAT-Negative;pRNAT-EZH2组,转染液加入重组pRNAT-EZH2质粒。将人胶质瘤U251细胞分四组用Lipofectin-2000TM (美国Invitrogene公司)介导进行转染。

2.方法

(1) RT-PCR检测U251细胞中EZH2 mRNA的表达:分别收集转染24、48、72小时细胞,使用Trizol (美国Invitrogene公司) 提取细胞总RNA,步骤按说明书。以RT-PCR法检测在siRNA干预下EZH2基因mRNA表达的改变。EZH2引物序列:上游5'-GCCAGACTGGGAAGAAATCTG -3',下游3'-TGTGCTGGAAAATCCAAGTCA -5',产物大小为86 bp。β-actin引物序列:上游5'-ATCTGGCACCAAACACCTTCTACAATGAGCTGCG -3',下游5'-CGTCATACTCCTGCTTGCTGATCCACATCTGC -3',产物大小为167bp。以EZH2与β-actin条带的积分吸光度比值表示EZH2 mRNA的相对含量。

(2)激光共聚焦显微镜检测U251细胞凋亡的形态学改变:在接种细胞之前,将清洁灭菌的盖玻片置于6孔培养板中;将转染后48小时的细胞以2×105个/m1的密度接种在6孔培养板中。培养24、48小时后小心吸去培养液,加入0.5ml细胞固定液,室温下固定10分钟。吸去固定液,用PBS洗两遍,洗涤时用摇床晃动,每次3分钟,吸尽液体。加入0.5ml Hoechst 33258染色液,染色5分钟。此过程也用摇床晃动。用PBS洗两遍,每次3分钟,吸尽液体。滴一滴抗荧光淬灭封片液于载玻片上,盖上贴有细胞的盖玻片,尽量避免汽泡,使细胞接触封片液。激光共聚焦显微镜检测,激发波长在352nm,发射波长在461nm。Hoechst 33258染色剂:购自美国Sigma公司。

(3) 四甲基偶氮唑蓝(MTT)法检测卡莫司汀对各组细胞的生长抑制:分别取pRNAT-EZH2组,pRNAT-Negative组,空白对照组的对数生长期细胞接种于96孔培养板内,每孔加入细胞1×104个,24小时后加人含药物的完全培养基,加入卡莫司汀(美国Medical Isotopes公司,用前新鲜配制)(10、25、50μmol/L,这三种剂量在每组3个孔中各加一种),每组设3个复孔,继续作用24 小时,每孔加入20μlMTT( 5 mg/ml)继续培养4 小时,吸弃去培养液,加入DMSO 150μl,酶标仪测定570nm处吸光度(A)值。根据3孔平均A值计算细胞生长抑制率(%) = (1-A实验组/A对照组)×100%。

(4)Caspase检测:所有的细胞裂解液均使用BD ApoAlert fluorometric Caspase Assay Plate试剂盒(BD Biosciences Clontech公司,美国)进行检测,按试剂盒说明进行操作。再采用分光光度计检测Caspase活性。

3.统计学处理;计量资料以均数±标准差(±S)表示,组间对比采用方差分析。所有数据使用SPSS11.5软件进行统计分析。

 

结  果

1.EZH2 siRNA转染U251细胞后对EZH2 mRNA表达的影响:pRNAT-EZH2组的条带亮度显著低于其余各组(图1),pRNAT-EZH2组在24、48、72h mRNA表达抑制率分别为58.19%、73.37%和74.58%,与空白对照组比较有显著性差异(F=539.125、F=554.135、F=597.321,P<0.01) (图2),且其抑制作用随处理时间延长而呈增长趋势。

 

图1 RT-PCR检测U251细胞72小时EZH2 mRNA的表达

1空白对照组;2脂质体组;3阴性对照组;4 pRNAT-EZH2组

 

图2 RT-PCR检测U251细胞72小时EZH2 mRNA的表达的百分率(P<0.01)

1空白对照组;2脂质体组;3阴性对照组;4 pRNAT-EZH2组

 

2.激光共聚焦显微镜检测U251细胞凋亡的形态学改变:空白对照组及阴性对照组细胞经Hoechst 33258染色后,激光共聚焦显微镜下呈现的细胞均匀蓝染,而卡莫司汀组及卡莫司汀加pRNAT-EZH2组细胞则检测出明显的细胞凋亡,细胞核或细胞质内可见浓染致密的颗粒状蓝色荧光及明显的荧光碎片,其中可见卡莫司汀加pRNAT-EZH2组细胞凋亡最多,见图3。

 

图3 激光共聚焦显微镜检测U251细胞凋亡的形态学改变

A 空白对照组;B 卡莫司汀组;C 阴性对照组;D 卡莫司汀+pRNAT-EZH2组

 

3.EZH2 siRNA对U251细胞卡莫司汀敏感性的影响:pRNAT-EZH2转染U251细胞后不同浓度的卡莫司汀的生长抑制率明显高于空白对照组和阴性对照组(P<0.01),而空白对照组和阴性对照组的生长抑制率差异无统计学意义(P>0.05)。表明细胞对卡莫司汀的敏感性增加,见表1。

表1 MTT法检测EZH2 siRNA对U251胶质瘤细胞药物敏感性的影响(±s,%)

组别

卡莫司汀

10μmol/L       25μmol/L      50μmol/L

空白对照组

2.21±0.32

17.43±3.51

42.32±4.27

阴性对照组

2.39±1.01

19.28±3.59

45.12±4.39

pRNAT-EZH2

15.34±1.72*

36.49±4.13*

67.16±4.57*

F

321.348

320.152

269.137

P

<0.01

<0.01

<0.01

注:与其它两组比较,* P<0.01 

 

     4. caspase 3活性检测结果:pRNAT-EZH2转染U251细胞后不同浓度的卡莫司汀处理的细胞caspase 3 活性明显高于空白对照组和阴性对照组(P<0.01),而空白对照组和阴性对照组的生长抑制率差异无统计学意义(P>0.05)。表明细胞的caspase 3 活性增加,见表2。

 

表2  EZH2 siRNA转染及卡莫司汀处理对U251胶质瘤细胞caspase 3 活性的影响(±s,相对荧光单位)

组别

卡莫司汀

0μmol/L     10μmol/L       25μmol/L       50μmol/L

空白对照组

1.00±0.05

1.59±0.27

3.97±0.36

7.85±0.17

阴性对照组

1.01±0.06

1.48±0.32

3.89±0.14

7.64±0.27

pRNAT-EZH2

1.93±0.04*

2.17±0.03*

4.91±0.06*

10.12±0.03*

P

<0.01

<0.05

<0.01

<0.01

注:与其它两组比较,* P<0.01

 

讨  论

胶质瘤具有高侵袭性,局部复发转移快,并对已知的化疗药物基本耐药。术后化疗在胶质瘤的综合治疗中占有重要地位,多药耐药是影响治疗效果的主要原因之一[3 ,4]。如何克服胶质瘤化疗耐药性是值得深入研究的课题。已有研究表明,化学药物所致胞毒作用的终末效应均为诱导细胞凋亡[5],激活细胞凋亡的能力是抗肿瘤药物的疗效主要检测标准[6],由于肿瘤细胞常存在凋亡信号转导途径缺陷,导致许多肿瘤对化疗药物产生耐受[5]。因此,通过沉默癌基因及活化凋亡信号关键分子而促进细胞凋亡,为提高肿瘤化疗敏感性提供了新思路。

EZH2是凋亡抑制蛋白家族中一类抑制凋亡,调节细胞分化因子[2]。目前已有研究发现在前列腺癌、胃腺、直肠癌等高度恶性转移性肿瘤中EZH2过度表达[2],在胶质瘤细胞中也有证据证明EZH2呈高度表达[7]。那么我们可以认为抑制EZH2在恶性肿瘤中的高度表达成为增强肿瘤细胞对化疗药物敏感性及凋亡能力的关键所在。

RNA干扰技术是通过小的双链RNA阻断体内特定基因的表达,促使mRNA降解,诱使细胞表现出特定基因缺失表达的技术,是目前沉默某些致病基因功能的高效及特异性手段。本实验通过构建针对EZH2基因的siRNA真核表达载体转入人胶质瘤U251细胞中。结果显示:阴性对照序列表达载体转染U251细胞后对EZH2表达无影响;而pRNAT-EZH2转染U251细胞后显著抑制了EZH2的mRNA(P<0.01),其中 pRNAT-EZH2组中 EZH2 mRNA表达水平比空白对照组最多下降了74.58%,提示本研究构建的siRNA真核表达载体的确能够在细胞内持续地表达siRNA,高效、特异的抑制EZH2基因的表达。

进一步研究发现空白对照组及阴性对照组细胞经Hoechst 33258染色后,激光共聚焦显微镜下呈现的细胞均匀蓝染,而卡莫司汀组及卡莫司汀加pRNAT-EZH2组细胞则检测出明显的细胞凋亡。可以证实转染EZH2 siRNA促进了胶质瘤细胞凋亡,在与卡莫司汀联合作用下,凋亡更加明显。

本实验通过MTT法检测转染前后卡莫司汀抑制细胞生长的情况表明:稳定转染EZH2 siRNA 真核表达载体后卡莫司汀对细胞生长抑制作用增加。转染EZH2 siRNA和卡莫司汀联合作用下细胞生长抑制率最高达到(67.16±4.57)%,相比未转染EZH2 siRNA的空白对照组和阴性对照组有明显提高(P<0.01)。caspase 3作为关键凋亡因子,本实验证实pRNAT-EZH2转染U251细胞后不同浓度的卡莫司汀处理的细胞caspase 3 活性明显增高(P<0.01)。以上研究结果显示:用RNA干扰技术抑制EZH2表达造成肿瘤细胞对卡莫司汀的耐受性降低。

过多表达EZH2可能并非激活肿瘤细胞化疗药物的耐受性和抗凋亡能力所必需的因素,但抑制EZH2表达可能作为有效的调控信号 ,提高肿瘤细胞对卡莫司汀化疗敏感性, 导致肿瘤细胞凋亡。本研究通过RNA干扰技术的应用为基于外科手术后调控细胞凋亡的生物治疗与化疗联合治疗胶质瘤提供了新的实验依据。

 

参考文献

[1] Bradley D, Rees J. Updates in the management of high-grade glioma. J Neurol. 2014;261(4):651-654. 

[2] Yamaguchi H, Hung MC. Regulation and Role of EZH2 in Cancer. Cancer Res Treat. 2014;46(3):209-222.

[3] Weller M, Pfister SM, Wick W, et al. Molecular neuro-oncology in clinical practice: a new horizon. Lancet Oncol. 2013;14(9):e370-379.

[4] Kim S, Jo S, Lee H, et al. Lobarstin enhances chemosensitivity in human glioblastoma T98G cells.Anticancer Res. 2013;33(12):5445-5451.

[5]Schmitt CA. Senescence, apoptosis and therapy-cutting the lifelines of cancer. Nat Rev Cancer, 2003, 3: 286-295.

[6]Chen N, Chen CC, Lau LF. Adhesion of human skin fibroblasts to EZH2 is mediated through integrin α6β1 and cell surface heparan sulfate proteoglycans. J Biol Chem, 2000, 275: 24953-24961.

[7] Qiu S, Huang D, Yin D, Li F,et al. Suppression of tumorigenicity by microRNA-138 through inhibition of EZH2-CDK4/6-pRb-E2F1 signal loop in glioblastoma multiforme. Biochim Biophys Acta. 2013;1832(10):1697-1707.

 

 

 

 








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