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动物模型论文 非酒精性脂肪肝研究中的动物模型研究进展

2019-01-26 14:39:39来源:组稿人论文网作者:婷婷

  摘 要 随着经济的发展,人民生活水平的提升,非酒精性脂肪肝的发病率逐年上升,且已成为全球最大的慢病。然而非酒精性脂肪肝的发病机制尚未得到完全的阐明,临床上尚无能够治愈非酒精性脂肪肝的药物,因此非酒精性脂肪肝动物模型的研究对于阐明脂肪肝的发病机制及开发临床治疗药物尤为重要。本文对国内外非酒精性脂肪肝动物模型及造模方法进行综述,对动物模型种类、造模方法及其生化、病理学的特点分析,并对近年来非酒精性脂肪肝动物模型的研究内容与优缺点进行阐述。

  关键词 非酒精性脂肪肝;动物模型;肝脏脂肪变性

  非酒精性脂肪肝(NAFLD)是指除酒精因素和其他明确的肝损伤因素所导致的肝脏脂肪堆积,以弥漫性肝细胞损伤和泡性肝脂肪变性为临床病理特征的肝脏病变,其病理改变主要有肝细胞脂肪变性、肝细胞气球样变、以淋巴细胞为主的炎细胞浸润和纤维化等。非酒精性脂肪肝的疾病发生发展主要是从单纯的肝脂肪变性到非酒精性脂肪性肝炎(NASH),以至于最终发展为肝硬化,甚至演变为肝细胞癌。因此,对非酒精性脂肪肝动物模型的研究在阐明脂肪肝发病机制以及药物治疗方面具有重要的意义。

  食物诱导方法

  食物诱导建立模型的方法重复性好,方法简便,价格低廉,病变过程与人NAFLD形成过程类似,是国内外常用的NAFLD模型。但是此造模方法具有用时较长,造模过程中动物易产生厌食或腹泻现象,模型动物病变较轻等缺点17。

  1.1高脂饮食法

  高脂饮食法是国内外常用的NAFLD的动物模型建立方法,是典型的营养失调性脂肪肝模型,与人类 NAFLD的发病机制及肝组织病理学特征相似。高脂饲料诱导法稳定性高,造模方法简单,模型成功率高且重复性好。但单纯用高脂饲料诱导脂肪肝所需时间较长,一般需要8-12周,且高脂饲料含有的猪油等油腻成分在夏季容易变质,产生异味,动物容易出现“厌食”现象1,且单纯的高脂饲料不符合中国居民以糖为主的饮食结构。因国内外各研究中心实验动物种系、喂养饲料成分、性别及饲养时间等因素的不尽不同,实验动物肝组织病变程度及病理类型也不一而足。

  王振2等的综述中对高脂饲料下不同品系大鼠的影响进行了总结,在相同实验条件下,用高脂饲料(脂肪占总热量的 71%)饲养 3 种不同种系雄性大鼠(Lewis、Wistar和SD大鼠),3周后所有大鼠超过66% 的肝细胞均发生不同程度的脂肪变性,脂肪变性的病理类型也不同。微孔状、混合性和空泡状脂肪变性均出现在3种大鼠的肝脏病理中,但只有SD大鼠肝脏组织中出现重度纤维化肝细胞损伤及中央静脉血流速度减少的现象,因此SD 大鼠对高脂饲料喂养具有更高敏感性。雄性大鼠(无论何种品系)更易发生肝脏病变,这也与男性和绝经女性非酒精性脂肪肝发病率高的现象相一致41、42。Nagaraj M.Kulkarni50等学者用高脂饲料(脂肪占总热量的 60%)喂养C57BL/6小鼠45天,小鼠体重相对与正常饮食组明显增长,小鼠呈现高血糖与高胰岛素症,小鼠的肝脏甘油三酯(TG)显著升高。

  1.2高糖饮食法

  果糖的过量摄入是饮食因素中导致脂肪肝的最常见的原因。动物研究表明,过量摄入果糖会促进脂肪的从头合成,导致血脂异常,特别是高甘油三酯(TG)血症、腹型肥胖、血糖增高及血压升高,表现为典型的代谢综合征;果糖的过量摄入还会使肝组织中活性氧类的生成增多,诱导肝脏脂质沉淀和肝脏胰岛素抵抗3。

  任路平3给予小鼠高糖喂养1周后取材,检测各项指标发现:小鼠的血胰岛素水平增高,糖耐量下降,单位体重附睾脂肪含量明显升高,且高糖组肝脏TG含量显著升高,证明短期高果糖饮食喂养可引起小鼠肝脏脂质沉积。韩然5等则是对雄性SD 大鼠轻度模型组给予高糖饲料(90%基础饲料+10%蔗糖)喂养12周,对重度模型组给予高糖饲料(80%基础饲料+20%蔗糖)喂养12周,轻度模型组及重度模型组均出现肝细胞脂肪变性,血清学检测发现谷草转氨酶(AST)、谷丙转氨酶(ALT)、CHO、TG水平皆升高,并出现胰岛素抵抗,但轻度模型组较重度模型组脂肪变性程度较低,各血清学指标升高也无重度模型组明显。Samir Softic等6研究了果糖分别在高脂与正常饮食状况下对肝脏脂肪合成的影响,正常饮食在果糖的添加下体重增加,并出现轻微的肝脏脂肪变性,但是并没有出现胰岛素抵抗;而高脂饮食添加果糖后小鼠出现肥胖、肝脏脂肪变性程度加重、胰岛素抵抗以及葡萄糖耐量受到破坏的现象。

  1.3胆碱-蛋氨酸缺乏饮食法

  胆碱与蛋氨酸是合成磷脂酰胆碱必需的前体,而磷脂酰胆碱是极低密度脂蛋白(VLDL)的重要组成成分,饮食中缺乏胆碱与蛋氨酸可干扰磷脂酰胆碱的合成以及VLDL的分泌,从而抑制VLDL在肝脏中对TG的转运作用,使TG在肝脏中累积,进而诱发NASH40。胆碱-蛋氨酸缺乏(MCD)饮食法称为国际上经典的非酒精性脂肪肝炎动物模型,造模方法简便且用时短,主要用于发病机制的研究和药物的筛选,许多学者利用这一模型来探讨NASH 和肝纤维化的发病机制。但MCD饮食价格昂贵,且人类肝脏中不含胆碱氧化酶,即不存在胆碱缺乏的问题,因此该模型的发病机制与人类完全不同,而且它缺乏人类NAFLD发生中心环节所具有的胰岛素抵抗8。

  Richard Kirsch40等用实验探究MCD鼠类脂肪性肝炎模型存在种类、品系和性别的差异。实验用MCD饲料喂养Wistar大鼠、Long-Evans大鼠、SD大鼠和C57/BL6小鼠各4周,其中Wistar大鼠的相对肝重显著增高,肝脏外观苍白含有脂肪;而Long-Evans和SD大鼠的相对肝重变化很小,外观接近正常。Wistar大鼠血清ALT水平与肝脏脂质含量显著高于Long-Evans和SD大鼠,各组中雄鼠的血清ALT水平与肝脏脂质含量显著低于雄鼠。Wistar雄鼠100%肝细胞具有大泡脂肪变性,而Long-Evans和SD雌鼠脂肪变性则轻微。C57/BL6雄鼠的坏死性炎症病灶显著多于雌鼠以及Wistar大鼠,脂肪变性却少于Wistar大鼠。C57/BL6小鼠血清ALT水平升高,出现超微结构损伤,且比Wistar大鼠更显著,主要有线粒体肿胀、粗面内质网与线粒体间失去正常联系。张琪娟9等用MCD饲料饲养11周龄的KM品系雌性与雄性小鼠4周,MCD喂养期间小鼠的体质重呈现下降的趋势,喂养后血清AST与ALT水平均明显升高,且雄性小鼠的上升趋势显著高于雌性小鼠,H&E染色结果显示雌性小鼠肝脏组织出现脂肪变性,肝细胞大泡样改变,但是炎症细胞聚集并不明显,而雄性小鼠病理改变较之更为严重,主要表现为大面积脂肪变性及肝细胞气球样变,且伴有明显的炎症细胞聚集。

  1.4禁食与复食结合摄入法

  许多研究表明可以通过营养物质的对肝脏脂肪的生成进行调节,例如在婴儿的断奶过渡期或者禁食后10。禁食后再进食导致脂肪肝的机制可能为肝脏合成脂肪酸与脂肪酸循环失衡以及甘油三酯的合成与分泌失衡17。禁食会导致各类脂肪组织中的脂类分解为脂肪酸,脂肪酸进入循环从而进入肝脏,肝脏则会将这些脂肪酸转化为酮体而作为其他组织的能量来源。该造模方法有时间短、成功率高、便于观察的特点;但禁食时间较长,对指标的测定影响较大,且不符合临床上脂肪肝的发病过程。

  Delzenne NM10等将雄性Wistar大鼠禁食48小时,然后给予高碳水化合物无脂肪的混合饲料。在给予混合饲料6小时后肝脏会形成小泡的脂肪变性,随着时间的进行,这种小泡性脂肪变性会逐渐病变为大泡性脂肪变性并向四周蔓延,至此成功复制了脂肪肝的模型。Gabriela S.F.Castro11等将雄性SD大鼠禁食48小时后用含63%高糖饲料进行喂养:24小时喂养后肝脏有大量脂肪的堆积,100%肝细胞受到损伤;通过喂养45天、60天、90天的结果对比来看,随着时间的增加脂肪堆积的肝细胞增多,但是在此种喂养模式中肝细胞脂肪的变性是轻微的,脂肪变性的肝细胞约占肝细胞的20%。

  1.5 高脂乳剂灌胃法

  用含高脂、蔗糖和蛋白组成的高脂乳液给动物灌胃复制的模型展现了与人类非酒精性脂肪肝的发生及向脂肪变性、脂肪性肝炎的病变过程相似的重要特征13。乳剂灌胃可使每只动物的摄食量均等,使造模的效果较为平均;可以避免因食物性质和气味的改变使动物厌食而影响造模进程 12。但高脂乳剂的高粘稠性、易凝固性等缺点给灌胃操作带来困难;频繁灌胃易造成动物消化道损伤;造模过程中动物易出现精神状态差与腹泻症状1。

  Ingrid C.Gaemers13等给10周大的C57BI/6J小鼠做胃插管手术,术后愈合5天后开始高脂乳剂的灌胃,然后分别在3周、6周、12周时取材分析。在本实验中小鼠的体重和肝指数都呈现明显的升高趋势,且肝内脂滴含量、胆固醇含量、游离脂肪酸的含量均增加。陈妍14等报道的SD大鼠非酒精性脂肪肝模型的形成是采用高脂乳剂和高脂饲料结合的方式,根据大鼠体重每周2次给以高脂乳剂,平时用高脂饲料喂养,连续喂食12周,在12周后通过随机处死大鼠测定CHO、TG值并制作病理切片以确定形成非酒精性脂肪肝模型。周大林等15采用逐渐增加高脂乳剂剂量的灌胃方法建立模型。按照第1周2.5 mL/(kg•d)、第2周5.0mL/(kg•d)、第3周7.5 mL/(kg•d)、第4周-第7周10mL/(kg•d)的高脂乳剂剂量每天上午给SD大鼠灌胃。SD大鼠在第三周即会形成高脂血症,第七周时肝脏体积明显增大,大量的肝细胞肿胀并出现气球样变,胞质内存在大小不等、数量不一的圆形空泡,细胞核居边缘,呈中度至重度脂肪变性。

  1.6玉米油注射造模法

  氧自由基反应和脂质过氧化反应在新陈代谢过程中起着重要的作用,正常情况下两者处于动态平衡的状态,这种平衡状态维持着机体的许多生理生化反应和免疫反应。玉米油中含有大量的不饱和脂肪酸,脂质过氧化是一中生产自由基的过程16,大量的自由基会打乱机体的动态平衡,而引起一系列的新陈代谢的失常,免疫功能的降低,氧自由基反应,继而损害生物膜及其功能,以致形成细胞透明性病变、纤维化,而细胞的大面积损伤会造成进神经、组织、器官等的损伤。且皮下注射玉米油后肝细胞氧化应激的标志-肝甘油三酯含量、硫代巴比妥酸反应物质和总谷胱甘肽均有变化17。

  Therese Bohm18等将雄性Wistar大鼠按照1ml/100g的剂量通过灌胃的方式分别给予高温处理过的玉米油(高温处理使玉米油过氧化)和未处理过的玉米油,连续给药6天。给予过氧化玉米油组的小鼠肝脏脂质过氧化程度明显加重,炎症因子水平明显增加,且在玉米油第一次灌胃8小时后,外周血液中游离的脂肪酸增加了大概1.5倍。

  1.7全胃肠外营养(TPN)法

  全胃肠外营养(Total parenteral nutrition,TPN)是指经静脉途径输入供给患者正常生理需要所必须的全部营养物质,包括水、糖类、脂肪、氨基酸、维生素、电解质和微量元素等,起到营养支持作用的治疗方法。但TPN常伴随着导管并发感染、喂养恢复综合症和肝功能损害等并发症41,其中NAFLD是TPN治疗过程中成人中最常见的并发症42。此种造模方法形成率高,时间短,但由于TPN操作复杂,其推广应用受到限制8。

  Dudrick8等首次用成年Wistar大鼠做深静脉插管造模,电脑输液泵将营养液以3 ml/h的速度持续输入,当输入的静脉营养液中的非蛋白能量占33%以上时,7天后的检测显示大鼠血清VLDL明显降低,TG输出受到抑制,肝脏出现明显的脂肪变性。Masuhiro NISHIMURA43等用3周龄的雄性SD大鼠造模,大鼠做静脉插管手术,术后每12h时按3ml/kg/h、10ml/kg/h、20ml/kg/h、30ml/kg/h的输入量输入TPN,经过2天梯度增长后,第3天增长到最大注射量40 ml/kg/h并持续到第4天,大鼠血清ALT、AST均出现大幅上升,肝细胞中出现明显的脂滴。

  2.基因模式动物

  基因工程动物模型能自发形成脂肪肝并同时具有胰岛素抵抗等代谢综合征特征,使之能从整体水平、组织器官水平及细胞分子水平等多方面研究NAFLD的发病机制,并进行NAFLD的药物筛选,是比较理想的实验体系,但是目前多数基因工程动物模型价格昂贵30,限制了其应用。

  2.1 基因敲入模型小鼠

  2.1.1脂肪nSREBP-1c转基因模型

  固醇调节元件结合蛋白-1c(Sterol regulatory element-binding proteins-1c,SREBP-1c)对于调控脂肪酸和甘油三酯合成具有重要意义,正常的非脂肪组织中脂肪含量的稳定性依赖于SREBP-1c对脂肪合成的调节,若其过度表达将导致非脂肪组织内脂质沉积聚集。Iichiro Shimomura20等在小鼠的脂肪组织中特异性转入nSREBP-1c基因,使其在脂肪组织中过量表达形成脂肪SREBP-1c转基因模型。脂肪组织过表达nSREBP-1c基因小鼠会产生胰岛素抵抗、糖尿病,以及先天的脂肪代谢的障碍并对脂肪细胞的分化产生影响。转基因小鼠出生7天后肝脏体积变大外观较白,伴随明显的肝脏脂肪变性;在12周是肝脏重量几乎为对照组的两倍,色泽苍白。此种模型内脏脂肪的含量随着肝脏脂肪的累积而减少,而由于人类非酒精性脂肪肝发生时常伴随着内脏脂肪的增加,因此该模型是否适用于典型的非酒精性脂肪肝研究还有待确定21,但该模型随着年龄增长而表现出的肝损伤表型及脂联素较低与人类NASH症状相似,所以该模型在这方面适用于对NASH的研究。Nakayama H22等利用该种模型研究脂联素对NASH的影响,在实验中nSREBP-1c 转基因模型在20周龄出现血清T-CHO与TG含量升高,AST、ALT水平不同程度上升的现象;30周龄时,组织学切片中观察到典型的NASH症状-肝脏出现大泡性脂肪变性,炎性单核细胞浸润以及纤维化。

  2.1.2肝脏AKT基因介导的小鼠

  蛋白激酶B(Protein kinase B,AKT或PKB)基因介导的NAFLD模型是通过使AKT在肝脏中高效表达,通过PI3K-AKT-mTORC1信号途径调节脂肪合成相关因子SREBP-1,SREBP-1调控FASN基因过表达,致使肝细胞的脂肪酸从头合成作用增加,肝脏中脂质含量得到显著的升高,小鼠肝功能损伤、脂质代谢紊乱,从而逐渐形成病变23。喻兆阳23等通过尾静脉高压注射给雌性FVB/N小鼠注射AKT/SB基因质粒,小鼠2周后就出现肝功能损伤,肝脏体积增大,大部分肝细胞肿胀并出现明显的脂肪沉积,血清CHO与ALT有明显升高的趋势。且造模随着造模时间的增长,其病变程度越严重。通过尾静脉高压注射AKT质粒建立NAFLD小鼠模型的方法,死亡率低、用时短、成本低且与人类疾病特征相似,避开了其他改良方法的缺点。

  2.2基因敲除模型小鼠

  2.2.1肝脏特异性敲除基因小鼠模型

  2.2.1.1肝脏生长激素受体特异性敲除( LiGHRKO)小鼠模型

  生长激素(Growth hormone,GH)是动物生长发育过程中重要的调控因子,在肝脏脂肪平衡的维持方面有着重要作用。GH的促生长作用通过IGF-1介导,IGF-1主要由肝脏产生其产生过程受GH调控。Yong Fan24等利用Alb-cre敲除了几乎全部的肝脏的生长激素受体(GHR)生成LiGHRKO模型小鼠,敲除肝GHR后,血液中GH的含量上升,IGF-1的含量下降低;小鼠表现出胰岛素抵抗,葡萄糖耐受,游离脂肪酸增多等现象,LiGHRKO雄性小鼠8周时的肝脏因为较多的脂肪累积而表现为白色,病理学切片显示有明显的肝脏脂肪变性,形成典型的非酒精性脂肪肝。Edward O.List44等研究了6个月的LiGHRKO小鼠,其血液GH的含量约增加了3倍,IGF-1的含量下降了约90%,血糖水平明显升高,肝脏体积增大,其中只有雄性小鼠肝脏TG含量显著上升且H&E染色显示有空泡。

  2.2.1.2 肝脏JAK2敲除(L-JAK2 KO)小鼠模型

  Janus kinases(JAKs)是一类非受体型酪氨酸激酶蛋白家族,迄今已有4 个成员:分别为JAK1、JAK2、JAK3、TYK2。JAK2作为该家族中的重要成员,广泛分布于体细胞胞浆中,参与免疫系统调节。JAK2与STAT家族的多个成员共同构成了多条信号途径,参与细胞生长、凋亡并与肿瘤发生有密切关系,是细胞信号转导途中的重要通路,它在调控机体一系列生理与病理的反应中发挥着重要作用25。Brandon C.Sos26等在肝脏特异性敲除JAK2,使得雄性小鼠在4周时肝脏体积增大,色泽发生改变;8周时肝脏细胞肿胀,并出现明显的脂滴,呈现大泡性脂肪变性;20周时出现严重的大泡性脂肪变性并伴随小叶性炎症与纤维增生,这些都是NASH的典型表现。肝脏中JAK2的表达量下降约74%,小鼠血清GH含量上升而IGF-1含量降低。Shi AY27等的研究表明,L-JAK2 KO小鼠能够自发的形成NAFLD,但是此模型的NAFLD病变过程却不包括肝癌,而且化学致癌物的诱导下还能对小鼠起保护作用,且L-JAK2 KO小鼠在MCD喂养下也只是表现了脂肪变性的症状,表明JAK2在脂肪肝炎的进程中起重要作用。

  2.2.1.3肝脏STAT5敲除(STAT5 LKO)小鼠模型

  信号转导及转录激活因子(Signal transducer and activator of transcription ,STAT)蛋白家族共有7个成员,分别为STAT1、STAT2、STAT3、STAT4、STAT5a、STAT5b、STAT6, 其中STAT5作为该家族的重要成员之一,是一种多功能的转录因子,STAT5蛋白既是胞质信号分子又是核转录因子,可起信号传递的作用,也可被多种细胞因子和生长因子激活,从而调控相应基因的表达。GH能够调控肝细胞的生理和病理学特征,且大部分GH信号是STAT5传递,肝细胞中STAT5的缺失可使GH信号传递过程阻断,从而导致脂肪肝的生成45。Yongzhi Cui28等在研究STAT5 LKO小鼠时发现,STAT5 LKO小鼠的肝脏细胞再生能力受到损害,血清IGF-1水平降低,而血清GH水平升高,胰岛素水平上升并伴随胰岛素抵抗的现象,小鼠10周龄时开始出现脂肪肝表型,17周龄的肝脏有显著的脂滴聚集,且肝脏TG含量从明显升高28。Myunggi Baik29等利用该模型小鼠研究肝脏STAT5对GH调节从而对胆固醇和胆汁酸代谢产生的影响,在实验中STAT5 LKO小鼠胆固醇水平、LDL受体与胆固醇合成相关基因的表达水平没有明显的改变,但是胆汁酸合成及吸收的相关基因的表达量明显下调,肝脏STAT5对胆固醇代谢基本没有影响,但是对胆汁酸的代谢产生了影响。

  2.2.1.4肝细胞特异性PTEN缺陷(PTENLKO)小鼠模型

  第10号染色体缺失的磷酸酶和张力蛋白同源物(Phosphatase and tensin homology deleted on chromosome ten,PTEN)是一种抑癌基因,其编码的PTEN蛋白具有蛋白磷酸酶和脂质磷酸酶双重酶活性。PTEN通过参与细胞内多条信号转导通路,在细胞的生长增殖和自我更新等方面起到重要作用,其中PI3K/AKT信号通路是它的主要调控途径,参与细胞的糖脂代谢、膜与囊泡的运输等生命活动46。Sumio Watanabe47等研究40周龄的PTENLKO小鼠模型时发现小鼠肝脏细胞呈现大泡性脂肪变性、气球样病变、小叶炎性细胞浸润以及旁窦状隙纤维化等人类NASH的典型症状,而在小鼠80周龄时,100%的PTENLKO小鼠肝脏发展成为肿瘤,其中66%患有肝细胞癌。Anne-Christine Piguet47等利用该模型研究规律运动对肝癌发展进程的影响,7-9周龄的PTENLKO小鼠经过32周的规律运动,71%的运动组小鼠肿瘤>15mm3而相对的静坐组是100%,运动相对减少了肝脏肿瘤的数量,降低了肿瘤细胞的增殖能力,但是运动并没有改善小鼠脂肪变性的程度,也没有改变NAFLD的发病进程。

  2.2.2全身敲除小鼠模型

  2.2.2.1 AOX-/-小鼠模型

  乙酰辅酶A氧化酶(Acyl-coenzyme A oxidase ,AOX)是长链脂肪酸β氧化的限速酶。AOX-/-小鼠缺失长链脂肪酸氧化过程,血液中长链脂肪酸累积,造成肝脏脂肪累积并进一步发展为脂肪性肝炎。AOX-/-小鼠在出生7天时肝脏即出现大泡性病变;30天时发展成为严重的肝脏脂肪变性并伴随着炎症;15月发展成为腺瘤甚至肝癌21。

  2.2.2.2 MAT1A-/-小鼠模型

  甲硫氨酸腺苷基转移酶(Methionine adenosyltransferase-1A,MAT1A)是一种肝脏特异性表达的对蛋氨酸代谢起限速作用的酶,能够催化合成S-腺苷蛋氨酸。MAT1A-/-小鼠的抗氧化物质水平降低,且与β氧化相关基因的表达量减少,在出生8月后会自发的形成NASH,肝细胞增殖速度异常。尽管此模型的血糖偏高,可是胰岛素表达水平正常,而且没有伴随其他代谢综合征21。

  2.2.2.3 ADK-/-小鼠模型

  腺苷激酶(Adenosine kinase,ADK)是核苷激酶的一种,在肝脏中高度表达,可催化腺苷为ATP磷酸化生成5’-腺苷酸和ADP反应。破坏腺苷激酶基因可成功建立出生后致死NAFLD模型。ADK-/-小鼠胚胎时期发育正常,但是出生后肝脏迅速积累脂肪,在4天内即会发生肝细胞小泡性脂肪变性,并会于14天内因脂肪肝死亡。在此种小鼠中,线粒体功能受到损伤,脂肪酸的运输与氧化功能进而受到伤害;腺嘌呤核苷酸的表达量下降,但是s-腺苷高半胱氨酸的表达量增加31。该模型建立的所需时间短,但最大的缺陷是模型的快速致死性,不能应用于药物疗效观察等方面的研究,实际应用受到限制30。

  2.2.2.4 ArKO小鼠模型

  芳香化酶(Aromatase ,CYPl9)是细胞色素P450酶系中的一种,是雌激素合成的最后一步限速酶,编码基因是CYPl9基因,它表达的芳香化酶的数量及活性直接决定了正常或异常组织中雌激素的水平32。Akiko Amano33等对ArKO小鼠的雌性与雄性的脂质与脂蛋白的代谢做对比分析,小鼠出生159天后对小鼠的肝脏与血清进行脂质含量及脂质或脂蛋白相关基因的表达进行检测:雄性小鼠出现肝脏脂肪变性并伴随着血清中睾酮含量的上升;血清中的低密度脂蛋白(LDL)和极低密度脂蛋白(VLDL)以及TG含量都会下降;在脂质合成基因方面,SREBP1和CD36的表达量都有显著的提升。而这些表型在雌性小鼠中都没有显著的体现,只有雄性小鼠表现出显著的肝脏脂肪变性的特征,ArKO小鼠表型出现性别差异。

  3.特殊品系动物的先天性遗传性脂肪肝模型

  特殊品系的动物模型可用于建立先天性和幼年型脂肪肝模型,可用于代谢综合征脂肪肝的研究,不适用于后天营养失调所致的脂肪肝的研究。这些动物模型品种少,死亡率较高且售价高,不利于推广应用,且仅适用于特定病理机制的研究35。

  3.1 foz/foz小鼠模型

  foz/foz小鼠模型是Alms1基因突变所得,Alms1基因是编码纤毛的基因,在细胞的物质运输与分泌方面起重要作用。foz/foz小鼠伴有肥胖、胰岛素抵抗、胆固醇水平升高以及肝脏脂肪变性的明显表型,其本身在正常饮食的情况下并不能发展成为肝炎,在经过高脂饮食诱导会呈现肝炎甚至纤维化的现象,但是这种现象有种属特异性,虽然BALB/C小鼠与C57BL/6J背景的foz/foz小鼠都会呈现肝炎现象,但是纤维化的现象只能在C57BL/6J小鼠中观察得到38。Fahrettin Haczeyni51等利用foz/foz小鼠研究运动对该种小鼠的脂肪含量及肝脏状况进行研究,foz/foz小鼠的内脏脂肪与皮下脂肪质量增加,且肝脏中存在大量微小的脂滴与轻微的肝炎,而运动能够显著的减少内脏脂肪与皮下脂肪的质量,并且能够减轻肝脏脂肪变性,炎症得到治疗。

  3.2 FLS(Fatty liver shionogi)小鼠模型

  FLS小鼠是利用近亲繁殖的方法建立的一个新种系的小鼠,可自发形成脂肪肝但不伴有肥胖和糖尿病,但糖耐量受到破坏。新生FLS小鼠的肝细胞含有脂滴,随着鼠龄增长脂滴增大,且肝内TG含量明显增加,并伴有血清ALT和AST的升高,易自发性形成肝癌30。Xiang Wang36等学者利用该模型研究依折麦布(ezetimibe)降脂类药物对NAFLD影响的作用机制,FLS小鼠在服用依折麦布4周后,病理学切片显示肝脏内脂滴减小,炎性浸润范围减小,肝脏内自由氧含量下降,微粒体甘油三酯转运蛋白(MTP)表达量上升,减缓肝脏TG的积累。

  3.3 JVS(Juvenile visceral steatosis)小鼠模型

  JVS小鼠存在原发性肉碱缺乏,小鼠血清中肉碱含量只有野生型小鼠的一半。肉碱的缺乏使脂肪酸转运进入线粒体的过程受阻,导致脂肪酸不能进入线粒体进行氧化分解,大量聚集在肝细胞内,导致小鼠幼龄时即会出现脂肪肝35。Andrea Felser37等研究决奈达隆(Dronedarone)对JVS小鼠肝脏线粒体β-氧化的影响,9-12周龄的雄性小鼠作为研究对象,给药剂量为400 mg/kg/day,野生型小鼠的体重下降了10%,ALT与胆红素分别增加了4倍与3倍,而JVS小鼠的体重则下降15%,ALT与胆红素分别增加了5倍与4倍,H&E染色显示小鼠肝脏出现炎症甚至坏死的现象,表示JVS小鼠与野生型小鼠的肝脏均受到打击,且JVS小鼠的肝脏状态相对于野生型小鼠更差。

  3.4 ob/ ob小鼠模型

  Ob/ob小鼠的瘦素基因产生突变,瘦素是一种由脂肪细胞产生脂肪因子,能够作用于下丘脑使之产生厌食的症状,因此ob/ob小鼠食欲旺盛,具有高血糖症、高胰岛素症、胰岛素抵抗等特点,可自发形成糖尿病、肥胖与NAFLD21。Wen-Yi Hu39等研究水飞蓟素(Silibinin)与普洱茶萃取物的联合作用对ob/ob小鼠脂肪肝的影响:联合用药调整脂肪的代谢,抑制脂肪的氧化应激反应与脂肪的合成,使小鼠的体重下降,血脂降低,肝脏炎症得到缓解。该种模型小鼠适合于研究由于代谢综合征引起的脂肪肝,但是这种模型不能自发的形成脂肪性肝炎以及肝脏纤维化21。

  3.5 db/ db小鼠模型

  Db/db小鼠的瘦素基因受体产生突变,其瘦素水平正常或升高,但是瘦素不能正常与受体结合发挥作用,ob/ob小鼠表现为典型的肥胖,同时具有胰岛素抵抗的特点,会自发形成糖尿病与大泡性脂肪变性为代表的NAFLD,但是并不能自发的形成NASH。Ye Yin38等探索了木犀草素(Luteolin)对db/ db小鼠NAFLD的作用机制,Luteolin喂养后肝脏TG水平降低,葡萄糖耐量得到改善,肝脏内脂滴聚集减少,肝糖原储存量增加,表明Luteolin对NAFLD具有治疗作用。

  4、小结

  综上所述,通过针对不同的影响因素而运用不同的造模方法建立的非酒精性脂肪肝模型对于从不同的角度研究非酒精性脂肪肝的发病机制、病理改变及治疗方法有着重要的意义,但是至今仍缺乏涵盖人类NAFLD整个疾病谱的单一动物模型。目前研究NAFLD的发病机制及治疗药物时仍然需要选择符合实验目标与接近人类NAFLD的形成过程与病变特征,且重复性好、操作简便、造模时间短、动物死亡率低的动物模型。

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