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药学研究论文 牡丹皮商品规格等级及化学质量评价研究

2019-02-03 20:13:16来源:组稿人论文网作者:婷婷

 

  摘要

 

  牡丹皮为常见大宗药材,市场交易量大。就目前市场调查来看,牡丹皮药材规格等级划分极不统一,因其缺乏统一的规格等级划分标准。因此制订统一合理的牡丹皮商品规格等级标准迫在眉睫。另外,市场上尚存在大量熏硫、脱硫及抽心率低的牡丹皮。而目前对不同规格等级的牡丹皮化学成分及质量评价研究主要集中在某几种化学成分的含量变化上,而针对熏硫、脱硫及抽心率低的牡丹皮的研究也较少,且并未对牡丹皮中总体化学成分进行阐述。因此,本研究将以Q-TOF-MS技术为主分析牡丹皮不同产地、不同加工方法(熏硫、脱硫、晒干)、不同部位化学成分的差异,为牡丹皮化学质量评价研究奠定基础;同时,对不同等级牡丹皮性状进行测定分析,分析外观性状与内在化学成分之间可能存在的关系,并制订牡丹皮商品规格等级标准草案。

 

  首先对不同规格等级的牡丹皮药材进行产地及市场调查,采集牡丹皮样品,并对不同规格等级的牡丹皮样品的性状数据进行测定,分析不同规格等级的牡丹皮性状数据特征,在此基础上制订了牡丹皮商品规格等级标准草案。市场上流通的牡丹皮主要按照产地分为亳丹皮、凤丹皮和川丹皮,按照是否去皮分为刮丹皮和原丹皮,又按照直径大小分为不同的等级。以亳丹皮产量最多,凤丹皮质量最佳,川丹皮产量逐年减少,现市场上不多见,而凤丹皮均未刮皮,其他产地的丹皮均存在刮丹皮和原丹皮。因此本次牡丹皮商品规格等级标准将凤丹皮归为一个规格,其他产地丹皮分为刮丹皮和原丹皮两个规格,各规格项目下又按照直径大小将其分为一级、二级、三级和统货。

 

  同时,运用UPLC-QTRAP-MS-MS及紫外分光光度法分别建立了牡丹皮中10种次生代谢产物及多糖含量测定方法,对不同等级的牡丹皮药材中的次生代谢产物及多糖含量进行了测定,对化学成分与外观性状之间的相关性进行了分析,结果表明牡丹皮牡丹皮中多种次生代谢产物的含量高低与其外观大小成负相关性,而多糖含量与外观性状的大小成正相关性,随着抽心率的提高,牡丹皮药材中多糖含量略有升高的趋势,而其他次生代谢产物的含略有下降的趋势。

 

  此外,建立了牡丹皮药材UPLC-QTOF-MS分析方法,对牡丹皮中不同类型化学成分的质谱裂解规律进行了探索和总结,并首次对牡丹皮中化学成分进行了详细系统的质谱解析,共解析化学成分122个;结合代谢组学分析方法分析了不同道地产区的牡丹皮药材中化学成分差异。垫江丹皮和安徽丹皮中主要差异性成分为没食子酸衍生物、丹皮酚及其苷类、芍药苷类,其中六没食子酰葡萄糖苷和七没食子酰葡萄糖苷及丹皮酚在安徽产丹皮中相对含量较高,而多糖、丹皮酚苷(丹皮酚新苷、丹皮酚原苷、Paeonol-O-β-D-glucoside和Suffruticoside A)、芍药苷类(芍药苷、苯甲酰芍药苷、Isomer of galloylpaeoniflorin)和Methyl gallate、Galloyl-3-O-methyl gallate在垫江丹皮中相对含量较高。

 

  针对牡丹皮的刮皮与去皮问题及抽心率问题,对牡丹根不同部位化学成分进行比较分析,结果表明从化合物种类的角度来看,牡丹根栓皮中含有的化合物种类最为丰富,有些成分仅在栓皮中检出。从化学成分的含量的角度来看,牡丹皮栓皮中芍药苷类和鞣质类成分的种类和数量均较多;韧皮中寡糖和丹皮酚苷类成分较多。牡丹根栓皮中鞣质类成分的种类及数量均较多。

 

  市场上的牡丹皮除按照产地分为川丹皮、亳丹皮和凤丹皮,按照是否去皮分为刮丹皮和原丹皮外,还按照熏硫程度的不同分为高硫货、低硫货和无硫货,此外为防止已熏硫的中药被检出二氧化硫超标,市场上还出现了脱硫的现象。针对这些问题,主要运用UPLC-Q-TOF-MS-PDA及UPLC-QTRAP-MS-MS技术及代谢组学分析方法对熏硫前后、脱硫前后化学成分以及牡丹根不同部位差异进行系统分析。结果表明:在熏硫的过程中共有15种含硫化合物产生,均为芍药苷类成分的6号碳上的羟基被硫酸酯化。同时,熏硫造成的酸性环境加速了初级苷类成分的水解,含量降低,而次级苷的含量升高。与熏硫样品相比,脱硫样品中多数化学成分的含量大幅度降低。

 

  关键词:牡丹皮,商品规格等级,品质评价,UPLC-QTOF-MS,UPLC-QTRAP-MS-MS

 

  序言

 

  新中国成立以来,我国共颁布实施了3次中药材商品规格等级标准,现行的是1984年由原国家医药管理局和卫生部联合颁布的《76种药材商品规格标准》,距今已30多年,至今,市场发生了翻天覆地的变化,此前的《76种药材商品规格标准》已不能完全满足市场需求。因此,制订新的中药材商品规格等级标准迫在眉睫。在此历史背景下,本课题组承担了牡丹皮商品规格等级标准的制订。就目前市场调查来看,牡丹皮规格等级划分混乱,主要表现在各产地、药材市场划分不一致,各个体经营户划分不一致。在各大药材市场牡丹皮个子极少,多为牡丹皮切片,且亳丹皮多见,川丹皮少见。另外各大药材市场上尚存在许多熏硫、脱硫、发霉和抽心率低牡丹皮。因此,有必要对牡丹皮商品规格等级及其在市场流通过程中存在的问题进行深入的研究。

 

  牡丹皮为毛茛科植物牡丹Paeonia suffruticosa Andr的干燥根皮,用药历史悠久,具有很高的药用价值。其味苦、辛,微寒。归心、肝、肾经。有清热凉血,活血化瘀之功效。用于热入营血,温毒发斑,吐血衄血,夜热早凉,无汗骨蒸,经闭痛经,跌扑伤痛,痈肿疮毒[1]。现代研究表明牡丹皮主要化学成分为酚类及酚苷类、单萜及单萜苷类,其他成分还有三萜、甾醇及其苷类、黄酮、有机酸、香豆素等[2]。现代药理研究表明其药理作用主要有抗炎、抗菌、对心血管系统的调节作用、中枢抑制作用、免疫调节功能等[2]。我国牡丹皮资源丰富,但大部分都没有得到充分的利用,造成了不必要的浪费[3]。近年来,随着人们对牡丹皮需求的不断增长,出现了盲目种植和以次充好的现象,市场上牡丹皮参差不齐,质量难以保证[4]。

 

  为规范牡丹皮在市场上的流通,指导各不同层次(中药制剂厂、中药饮片厂、药店等)消费者根据各自不同购买目的,有选择地购买满足各自需求的中药材,发挥各不同等级牡丹皮的优势,同时又可以最大程度地利用牡丹皮资源,本研究将从不同角度研究各不同规格等级牡丹皮的外观性状及理化参数,并对其表面性状及理化参数可能存在的内在联系进行数据分析,以期能够最大程度地引导消费者科学合理地消费,减少牡丹皮资源的浪费,为牡丹皮资源的合理应用提供科学的参考依据,为牡丹皮商品规格等级标准的制定提供科学依据。对不符合药典规定的熏硫、发霉、未抽心牡丹皮中的特异性化学成分进行定性定量研究,并从化学成分的角度,阐明不科学的加工方法对牡丹皮质量带来的负面影响,为指导牡丹皮科学加工及其在流通过程中的化学鉴别提供依据。1.1本草考证

 

  1.1.1名称考证

 

  元代以前牡丹皮以“牡丹”为正名载于历代古籍中,至金.张元素《潔古珍珠囊》[4]以后才以“牡丹皮”为正名载入此后的文献中,此处用“牡丹皮”是因为陶弘景[5]提出牡丹在药用时,需去木心。此后牡丹皮多以“牡丹皮”为正名载于此后的文献中。直到明.兰茂《滇南本草》[6]中首次有以“丹皮”为正名的记载。除“牡丹”、“牡丹皮”、“丹皮”以外,牡丹皮尚有“鹿韭”、“鼠姑”、“吴牡丹”、“百两金”、“国色天香”、“花王”、“富贵花”、“木芍药”、“山牡丹”等多种别名。

 

  1.1.2基源考证

 

  1.1.2.1古文献中所描述的牡丹形态总结

 

  宋代以前的文献中对牡丹的形态描述比较简单,魏晋时期《吴氏本草》[13]记载:“叶如蓬相值,黄色,根如指,黑,中有毒核。”唐代《唐本草》[9]记录为:“剑南所出者苗似羊桃,夏生白花,秋实圆绿,冬实赤色,凌冬不凋。根似芍药,肉白皮丹”。随着人们对牡丹认识的加深,宋代《本草图经》中对牡丹的原植物和药材的性状描写比较详细,并且对野生和花农所种供观赏的牡丹有了区别。该书所提到的“山牡丹”即为现今野生单瓣花型牡丹[15]。《本草衍义》中指出牡丹入药以单叶花红者为佳,家种牡丹次之,移枝嫁接的不能用,并且分析了嫁接牡丹不能用的原因是:花叶多者,夺取了牡丹根部的营养。明清时期古籍中对牡丹花的颜色、花瓣类型、种子颜色、根的形态、颜色及长短均有详细的描述。纵观牡丹皮古文记载发现,后世对牡丹皮的形态描述均是在前人的基础上有所增补,说明清代以前丹皮的主流品种来源并未发生变化,因此以比较有代表性的《本草图经》和《本草纲目》为基础,以其他古籍资料为参考,按其苗、叶、茎、花、果、根的形态,对“牡丹”的植物学形态特点作以下总结:

 

  苗:“苗似羊桃”“二月于梗上止发五六叶耳”说明牡丹于阴历二月开始发芽,小苗仅有五六片叶片,小苗叶片形如杨桃。“苗似羊桃”:经查在古代有两种植物均“羊桃”,一种是现在的猕猴桃Actinidia chinensis Planch,一种是杨桃Averrhoa carambola。[16]其中杨桃苗与牡丹苗形态较为相似。

 

  叶:“叶如蓬相值,黄色”“二月于旧梗上生叶如掌大”表明牡丹的叶片复叶如手掌大小,相互覆盖。经查,本草中“蓬”一般是“蓬蘽”的简称,多指蔷薇科植物覆盆子Rubus chingii Hu或同属植物蓬蘽Rubus hirsutus Thunb。[17]

 

  茎梗:“其茎便枯燥,黑白色”“高三四尺”表明牡丹茎木质,高约一米,土灰色。“茎梗枯燥”:是指丹皮茎杆干枯,木质化。

 

  花:“花有黄、紫、红、白数色”“花亦有绯者...今禁苑又有深碧色者”“如芙蓉而大,繁丽可爱。”“惟取红白单瓣者入药”“惟单叶单瓣野生者...止用红白花者”“其花、叶与人家所种者相似,但花只五、六叶耳”说明牡丹品种繁多,但仅有开红、白花,花瓣单瓣型者做药用。“夏生白花”“三月开花”说明牡丹花约于阴历3月开花。

 

  果实:“秋实圆绿,冬实赤色”“五月结子,黑色,如鸡头子大”“五月结子黑色,类母丁香”“五月结子圆,绿色,如鸡头子大”表明牡丹秋天果实为绿色,冬季为赤红色,种子黑色,像芡实一样大小。“鸡头子”:学名为芡实,别名“鸡头子”。

 

  根:“根如指”“根黄白色,可五、七寸长,如笔管大”“中有毒核”“根似芍药”“其根皮红内白”“皮色外红紫内粉白”说明牡丹根外皮红色,肉质黄白色,具粉性,木心易于除去。“根似芍药”:现今所用的芍药也为毛茛科植物,其根的形态与牡丹相似。

 

  另外,《植物名实图考》中简单记载了药用牡丹的种植技术,认为:“入药必用单瓣者...种牡丹者必剔其嫩芽,则精脉聚于老干,故有芍药打头,牡丹修脚之谚。”此处的“嫩芽”是指“脚芽”即从根茎上萌发的芽。摘除部分“脚芽”是为了使牡丹花叶少发,避免其力移于花叶而薄于根。[11]

 

  1.1.2.2历代药图证据

 

  历代本草中除对牡丹有文字描述,有的还附有图片。从宋代到清代历代本草中牡丹图除了有重瓣和单瓣的差别以外,其叶片形态,复叶片数,花瓣瓣型等均无明显差别,因此以最早出现的《本草图经》中的牡丹图为主进行分析,由图1-1中可以看出,牡丹为灌木,叶为二回三出羽状复叶,互生,顶生小叶三深裂,单花着生于枝顶,花有单瓣和重瓣(药用牡丹为单瓣牡丹)。

 

  综上所述,本草古籍中药用牡丹的原植物特点为:灌木,高约一米,茎梗枯燥,土灰色。于阴历二月开始发芽,小苗仅有五六片叶片,叶为二回三出羽状复叶,复叶如手掌大小,互生,小叶卵形,顶生小叶三深裂,花有单瓣和重瓣,单花着生于枝顶。花期为阴历三月。品种繁多,但仅有开红、白花,花瓣单瓣型者做药用。秋天果实为绿色,冬季为赤红色,种子黑色,如芡实一般大小。根外皮红色,肉质黄白色,具粉性,木心易于除去。《中国植物志》[20]记载牡丹P.suffruticosa Andr二回三出复叶互生,小叶卵形,3~5裂,单瓣或重瓣,顶生小叶3深裂,裂片再浅裂。与古籍记载药用牡丹原植物性状一致,均为牡丹P.suffruticosa Andr。此结论也与徐国钧[21]、张秀云[22]等认为古今药用牡丹同源的推论一致。

 

  1.1.3产地变迁

 

  《神农本草经》曰:“土地所出,真伪新陈,并各有法”[7]。《本草经集注》有云:“诸药所生,皆有境界”[5]。中药产地自古以来就被历代医家所重视,如:孙思邈、李时珍、刘文泰等。明代官修本草《本草品汇精要》中还明确提出“道地”一词,为后世所认可,成为优质药材的代名词。自牡丹有栽培历史以来,各地到处引种,导致其种质、性状、质量等发生变化。现对药用牡丹产地变迁及品质评价做以下梳理。

 

  1.1.3.1南北朝以前

 

  有关牡丹皮产地和品质评价的记载最早见于秦汉时期《神农本草经》[4]记载:“牡丹,一名鹿韭,一名鼠姑。味:辛,寒。生山谷。出巴郡(指今四川、重庆长江与嘉陵江以北地区)。”汉代(赵九州等[23]通过本草考证认为《范子计然》的成书时间应不早于汉武帝时期,不晚于两汉之际。而非春秋时期范蠡所著)《范子计然》:“出汉中(今陕西秦岭以南地区,西汉时辖西城县、旬阳县、南郑县、褒中县、房陵县、安阳县、成固县、沔阳县、钖县、武陵县、上庸县、长利县)河内(春秋初期统指晋国所在地区,后向东延伸,达于黄河东段,主要位于今山西省境内,还包括河南、河北部分地区[24])。赤色者亦善”[4]。《名医别录》[25]:“生巴郡及汉中”。《本草经集注》[5]:“今东间亦有(此处“间”应表示方位,“东间”可能指东部地区,陶弘景为今江苏南京人,后谪居江苏茅山,故此处东间可能指浙江及附近省市。)”。

 

  早在秦汉时期,《神农本草经》对丹皮已有明确的产地记载,说明丹皮作药用已有2000多年历史,但由于当时人们活动范围有限,对丹皮产地的了解比较局限,认为丹皮产于今四川、重庆长江与嘉陵江以北地区,并对丹皮生态环境进行了简单的描述:“生山谷”。《范子计然》记载丹皮产于今陕西秦岭以南、山西及附近省份(但不知何故,此后本草中未见丹皮产于山西的记载。)。并首次对其品质好坏作了评价,认为色赤者品质亦佳,此处“赤色”不知是指花色还是根皮色。明代李时珍[8]曾认为:“牡丹以色丹者为上,虽结子而根上生苗,故谓之牡丹。”“牡”在古代有“阳性的,好的”的意思,因牡丹以色丹者为好,故名“牡丹”。《名医别录》则将此前本草中记载丹皮产地进行了简单总结,认为牡丹产于“巴郡、汉中”,汉代“巴郡”、“汉中”相邻,系指今陕西秦岭以南至四川及重庆长江及嘉陵江以北地区。

 

  南朝时期陶弘景认为除陕西、四川、重庆以外,“东间”亦有。有向东迁移的趋势,但不知“东间”具体所指。

 

  1.1.3.2唐代

 

  《唐本草》[9]:“生汉中、剑南(秦时巴郡及蜀郡,唐时改为剑南道,治成都府,因属剑门关以南,故名)。苗似羊桃,夏生白花,秋实圆绿,冬实赤色,凌冬不凋。根似芍药,肉白皮丹。土人谓之百两金,京下(今陕西西安)谓之吴牡丹者,是真也。今俗用者异于此,别有臊气也。(刘晓龙等[26]认为此处所载牡丹应不为今药用牡丹,而是紫金牛科植物朱砂根Ardisia crenata.。)”《四声本草》[9]:“今出合州(秦时蜀地,今四川合川市及附近县、市)者佳。白者补,赤者利。出和州(今安徽和县、马鞍山市及附近县、市),宣州(今安徽宣城及其附近县市)者并良。”此处“白者补,赤者利”不知是指花色还是皮色。

 

  唐代官方本草的修订加深了对丹皮产地及品质评价的认识,丹皮产地继续向东扩展至安徽,唐时期“和州”、“宣州”相邻,位于今安徽、江苏、浙江三省交界处,认为产于安徽及四川、重庆者佳。此后历代本草中对安徽丹皮均有记载,且多认为位于安徽东部与江苏及浙江交界处所产丹皮质量较好。与现今认为牡丹以产于今重庆垫江及安徽铜陵者为佳的品质评价较为一致。

 

  1.1.3.3宋、元时期

 

  日华子云:“巴(“巴州”、“渝州”秦时具属巴郡,位于今四川、重庆境内。)、蜀(“蜀州”唐时属剑南道,位于今重庆及附近县、市。)、渝(今重庆市境内)、合州(今四川重庆、垫江一带)者上,海盐(今浙江海盐)者次”[9]。苏颂《本草图经》[9]描述为:“牡丹,生巴郡山谷及汉中,今丹(今陕西宜川境内)、延(辖今陕西甘泉、延安、安塞、延长、延川、志丹)、青(今山东益都、广饶、寿光、昌乐、潍坊、昌邑等地)、越(今浙江绍兴、诸暨、萧山、上虞、慈溪、余姚、兴昌、嵊县)、滁(今安徽来安、滁州、全椒一带)、和州(今安徽含山、和县一带)山中皆有之。”元代《本草衍义补遗》:“唯山中单叶花红者(应是指野生单瓣,开红花者。)为佳”[4]。

 

  宋代丹皮产地向东扩大至浙江、山东。《日华子诸家本草》总结了唐及五代时期的药物成就[27],日华子本人为今四明(今浙江鄞县)人,对浙江本土产药比较熟悉,他记载今浙江海盐亦产丹皮,质量较次,而安徽、四川、重庆所产者质佳。牡丹作为观赏花卉栽培始于隋朝,到了宋朝陕西、山东、河南、浙江、四川等地均有大量栽培[28],此处海盐者次可能是指观赏牡丹。宋代政府组织了多次本草修订工作,影响最大的是《图经本草》,该书记载除陕西、四川、重庆、安徽以外,新增山东和浙江两个新产地。对于丹皮的品质评价,元代《本草衍义补遗》认为相对于家种千层异品者,野生单瓣开红花者质量较好。该书中首次明确提出,牡丹以野生单瓣花红者为佳,后世皆认为药用牡丹应为单瓣牡丹。

 

  1.1.3.4明代

 

  《本草纲目》[8]:“时珍曰∶牡丹,以色丹者为上…惟取红白单瓣者入药。其千叶异品,皆人巧所致,气味不纯,不可用。”《药性粗评》[4]:“生江南川谷,以巴蜀、汉中者为胜。近世出和、滁等州者亦良。”“人家种植者,多事穿凿尖,其根性不甚入药。”《本草蒙筌》[10]:“多生汉中巴郡”。《本草乘雅半偈》[12]:“覆曰:出汉中、剑南,及丹州、延州、青州、越州、滁州、和州,近似洛阳者为胜”(对明代以前有关药用丹皮产地的描述进行了总结,认为牡丹产于陕西、四川、重庆、山东、安徽、浙江。该书中还对观赏牡丹的各个品种进行了较为详细的叙述,而“近似洛阳者为胜”可能指观赏牡丹,而非药用牡丹)。

 

  明代本草多是对明代以前本草内容的总结和完善,此时期药用牡丹仍然分布于陕西、安徽、四川、重庆、山东、浙江。在丹皮的品质评价上,明代相关著作有明显的进步,明确提出观赏牡丹不能药用,李时珍还对观赏牡丹不能药用的原因做了解释,认为观赏牡丹气味不纯,故不能药用。同时认为以四川、重庆、安徽所产丹皮质量较好,与今认为牡丹以重庆垫江、安徽铜陵所产者为佳的品质评价基本一致。

 

  1.1.3.5清代

 

  清代《本草汇笺》:“通取皮厚实而粗大者佳。”[4]《本草备要》:“单瓣花红者入药,肉厚者为佳”[4]。在明代品质评价的基础上更进一步:以药材粗细、皮部厚度论好坏,均认为丹皮以皮厚实,粗大者为佳,几乎与现代普遍依大小论品质的评价方法一致。

 

  1.1.3.6民国

 

  民国.《增订伪药条辩》:“用者当属苏丹皮为美。炳章按:丹皮产苏州阊门外张家山闸口者,皮红肉白,体糯性粉,无须无潮,久不变色,为最佳第一货。产凤凰山者,枝长而条嫩,外用红泥浆过,极易变色,亦佳。产甯国府南陵县木猪山者,名摇丹皮,色黑带红,肉色白起粉者,亦道地。滁州同陵及凤阳府定远出,亦名摇丹。有红土、黑土之分。红土者,用红泥浆上,待后其土色红汁浸入肉内,白色变红;黑土乃本色带紫,久远不变,亦佳。产太平府(今安徽省马鞍山市当涂县和广西壮族自治区崇左市江州区。)者,内肉起沙星明亮,性粳硬,为次。以上就产地分物质高下,其发售再以条枝分粗细大小,以定售价贵贱。选顶粗大者,散装木箱,曰丹王。最细碎作大把者,曰大把丹。其产地好歹与粗细,以别道地与否。然皆本国出品,非外国货也”[14]。

 

  曹炳章认为苏丹、凤丹、摇丹品质较好,而产于安徽涂县及广西崇左者“内肉起沙星明亮…为次”,此处明亮沙星应为丹皮酚结晶,认为肉眼可见的丹皮酚结晶多者质量较差,与现代认为亮银星多者为上的说法相悖。该书中还提出丹皮质量先按照产地分质量好坏,再按照大小粗细定售价,与现今丹皮先按产地及加工方法分规格,各规格项下再按大小粗细分等级的规格等级划分标准基本一致。

 

  综上述,历代本草中所载丹皮产地大致位于黄河中下游至长江流域之间,有自西向东变迁的趋势(见图1-2),多以产于今陕西与四川交界处及今安徽、江苏、浙江三省交界处者为佳。南北朝以前产于四川、重庆、陕西、山西,可能华东地区亦有;唐代新增安徽;宋代新增山东和浙江。

 

  1.1.4历代品质评价

 

  唐以前均认为牡丹以产于四川、重庆者为好,以皮色红者为佳。唐宋元时期牡丹开始有药用和观赏的区分,药用牡丹以产于安徽、重庆的野生单瓣花者为佳。明代药用牡丹以产于陕西、四川、重庆、安徽者为胜。清时期对牡丹皮的性状评价较为细致,大多认为牡丹皮以皮厚体粗、无须无潮、体糯性粉、不易变色者为佳。目前丹皮在外观性状上以皮厚,体粗,香气浓,亮晶星多者为上,并且多认为以安徽铜陵和四川垫江所产者为佳。(详情见表1-1)

 

  1.1.5讨论和结论

 

  元代以前牡丹皮以“牡丹”为正名载于历代古籍中,至金.张元素《潔古珍珠囊》以后才以“牡丹皮”为正名,此后牡丹皮多以“牡丹皮”为正名载于此后的文献中。直到明.兰茂《滇南本草》中首次有以“丹皮”为正名的记载。本草古籍中药用牡丹的应为今之牡丹P.suffruticosa Andr,与徐国钧[21]、张秀云[22]等古今药用牡丹来源一致的推论一致。历代本草中所载丹皮产地大致位于黄河中下游至长江流域之间,有自西向东变迁的趋势。元代认为单瓣牡丹质量较好,至明代,均强调药用牡丹为单瓣牡丹,而观赏园艺栽培品不堪入药。清代丹皮开始以粗细、皮厚论好坏。民国时期丹皮质量好坏的划分已与现代商品规格等级的划分基本一致,先以产地和加工方法分好坏,再以大小粗细、皮部厚度定价格,现代研究表明,丹皮酚主要分布于栓皮部,皮部越厚,根皮越粗,丹皮酚和芍药苷的含量越低。清代以前多认为丹皮以产于陕西秦岭以南至今四川、重庆以北地区及今安徽、浙江、江苏三省交界处为佳,现代多以产安徽铜陵者为上,还有人认为重庆垫江所产者质佳。

 

  1.2牡丹皮商品规格等级及质量评价研究现状

 

  为全面收集牡丹皮商品规格等级资料,查阅《神农本草经》、《新修本草》、《本草经集注》、《本草纲目》等本草古籍,发现本草古籍中均未提及牡丹皮的商品规格等级。查询《中华本草》、《中国药材学》、《500味常用中药材的经验鉴别》等近现代文献资料,同时对1963年版以来的各版药典及全国各省中药饮片炮制规进行了汇总(详见附录1)。其中以《76种中药材商品规格等级》[5](1984)奠定了牡丹皮商品规格等级划分的基础,将牡丹皮按照产地及加工方法分为凤丹、连丹和刮丹三种不同的规格,各规格项下又按照长短粗细等外观性状分为四个不同的等级。《中国药材学》[6]、《现代中药材商品通鉴》[7]、《500味常用中药材的经验鉴别》[8]、《金世元中药材传统鉴别经验》[9]均在此基础上有所增补。以《中药材商品规格质量鉴别》最为详细,《中药材商品规格质量鉴别》[10]中将按照产地将牡丹皮细分为凤丹皮、瑶丹皮、连丹皮、湘丹皮、川丹皮,凤丹皮又按照大小各分为4个不同的等级;瑶丹皮按照加工方法分为刮丹皮和连丹皮,刮丹皮和连丹皮项下又按照大小分四个不同等级;湘丹皮按照加工方法分为连丹皮和刮丹皮,连丹皮和刮丹皮不再分级,均为统货;川丹皮仅有统货一个等级。

 

  为区分各地产丹皮,曾出现过各种与产地相关的商品名:产于安徽铜陵凤凰山称凤丹皮;产于安徽南陵者称瑶丹皮;产于湖南邵阳、新邵等地者称湘丹皮;垫江、灌县所产称川丹皮;四川西昌所产称西昌丹皮,认为安徽铜陵、南陵、重庆垫江均为道地[31-33,38,39]。在外观性状上以皮厚,体粗,香气浓,粉性足,断面粉白、无木心、亮晶星多者为上[31,33,36-42]。谢宗万等认为,与野生山牡丹相比,栽培牡丹质量较好,主要由于人们在栽培技术上有了改进和提高。最主要的手段就是将大部分花芽摘除,令其不开花,使营养集中于根部[40]。目前认为影响丹皮质量的因素主要有品种、产地、药用部位、加工、采收、生长年限、存放时间等。

 

  1.2.1品种

 

  当前,牡丹分布较广,几乎遍及全国各地,且各地均有观赏牡丹作药用的情况,而明代本草中明确指出家种观赏牡丹不能药用,用者当以花红、白单瓣者。历代本草中所用牡丹皮应为芍药属牡丹组植物无疑。从1963《中国药典》规定丹皮的原植物为毛茛科(Ranunculaceao)植物牡丹(P.suffruticosa Andr.),此后历史版中国药典中均沿用该说法。沈宝安等[43]认为安徽铜陵和南陵产丹皮有三个混生类群,包括多果牡丹(有人称为药用牡丹)P.ostiiT Honget J.X.Zhang subsp.Lishizhenenii(B.A.Shen)B.A.Shen.,杨山牡丹P.ostiiT.HongetJ.X.Zhang.和银屏牡丹P.yinpingmudan(D.Y.Hong,K.Y.Pan et Z.W.Xie)B.A.Shen.。很多学者[44,45]认为牡丹P.suffruticosa Andr.为牡丹组多种植物的杂交复合体,没有稳定的性状特征,其中的花单瓣者也为正品丹皮的来源之一。作药用的P.suffruticosa Andr.主要产于四川。章文伟等对垫江白花单瓣、红花单瓣及红花重瓣牡丹栽培品中乙醇浸出物、芍药苷、丹皮酚的含量进行测定,结果表明白花单瓣这一品种的乙醇浸出物、芍药苷含量在三个品种中最高,且其丹皮酚含量也较高。因此认为白花单瓣是较优的品种[46]。

 

  1.2.2产地

 

  据本课题组市场及产地调查,目前,丹皮产地有安徽、四川、重庆、河南、山东、陕西、山西等地。其中主要产区为安徽,以亳州产量最大,以安徽铜陵地区所产丹皮质量最佳。重庆垫江所产丹皮受丹皮价格下降的影响及观赏牡丹高利润的冲击,产量逐渐萎缩,而其他产地的丹皮多为观赏牡丹的副产品,在市场上并不多见。不管是以丹皮酚含量、无机元素含量,还是多种成分为含量测定指标评价丹皮质量,均证明铜陵丹皮质量较好,验证了丹皮以安徽铜陵产者为好的说法[47-55]。铜陵及垫江丹皮中丹皮酚含量明显高于其他产地,铜陵丹皮中其他多种成分(丹皮酚、丹皮总苷、丹皮多糖)含量亦明显高于其他产地,证明以铜陵及垫江所产者为胜的说法具有依据[51,53,56,57]。

 

  1.2.3药用部位及加工方法

 

  在丹皮的质量评价上,多认为以无木心者为佳。历版药典规定丹皮作为药材要抽去木心,而在实际生产中不可能将木心全部除去,抽心难易程度与直径有一定的关系,直径大的抽心较为容易,抽心率相对较高,售价也较高。对于丹皮是否需要刮皮、去心,多数学者认为牡丹皮不应刮去外皮,但是应该抽去木心。范旭航等[58]认为丹皮在加工的过程中不应去皮。牡丹皮的主要成分如:没食子酸、芍药苷、苯甲酸、苯甲酰氧化芍药苷、苯甲酰芍药苷和丹皮酚在连丹皮中的含量高于刮丹皮。在加工过程中刮去栓皮,对丹皮的质量有一定的影响[59]。木心中含有丹皮中所含有的各种成分,但木心中丹皮酚及浸出物含量较低,加工中抽去木心有利于减少加工中的干燥时间[60,61]。周斌等[62]采用紫外分光光度法测定了丹皮不同加工品中丹皮酚的含量,也认为牡丹皮产地加应以刮皮去心者为佳。

 

  不同加切片方法对牡丹皮中丹皮酚和丹皮总苷含量有一定影响。许玲[63]等认为结合饮片外观性状,鲜丹皮产地烘至一定程度直接切段,其质量较好。鲜牡丹皮在不同加工工艺条件下丹皮酚含量由高到低依次为:鲜丹皮烘至一定程度切段>产地趁鲜直接切段>干燥品润后切段。而低温烘干与烘房烘干除烘干时间不同,对其内在质量无明显影响。高温加工会导致丹皮中丹皮酚的损失,且温度越高,丹皮分的损失越严重。依照老药工的经验,丹皮有“丹皮封刀”的说法。该结果证明了丹皮传统切制方法(低温下切制)的科学性[64]。

 

  1.2.4其他影响因素

 

  研究表明五年生丹皮中丹皮酚的含量达到最大值。此后随着生长年限的增加,丹皮酚含量略呈下降的趋势[65-67]。但移栽五年生丹皮与四年生丹皮相比,其干重增加量不大,因此认为移栽丹皮四年采收为好。龙全江等[68]的研究则表明四年生丹皮中丹皮酚含量明显高于五年,六年生丹皮药材。川丹皮中多组分化学成分在第五年达到最高,其变化规律与丹皮酚不呈正相关[69],因此丹皮应以四到五年生为好。

 

  本草文献中记载丹皮采收期为阴历二月、八月。阴历二月、八月约为阳历三月、九月,牡丹六到八月月开花、结子,三月、九月采收正好避过花期和果期。陈奇等[70]研究表明,在花盛开期及枝叶枯萎期牡丹酚含量较高。九月初采收的丹皮乙醇浸出物、丹皮酚、芍药苷含量均较高[46]。十月份川丹皮样品丹皮酚平均含量最高[69],凤丹皮药材随着贮藏生长年限的延长,牡丹酚挥发,其含量呈逐渐下降的趋势,值得注意[70]。

 

  为保证家种药用牡丹质量,大多在牡丹在开花期将花芽掐去,使营养成分积于根部[40]。近年来,牡丹籽油以其富含α-不饱和脂肪酸的特点成为为业内关注的热点,受此影响,亳州、铜陵等地所产牡丹皮多于牡丹籽采收后采收,然而牡丹留籽对丹皮质量是否有影响有待研究。

 

  丹皮酚作为丹皮质量评价的指标性成分,具有抗菌、抗氧化、抗肿瘤等药理活性[71]。《增订伪药条辩》中认为内肉起沙星者质次,而现代著作中多认为结晶状物多者为佳,这些沙星和结晶状物均指丹皮酚在丹皮内部析出,形成的结晶状物质。铜陵所产丹皮丹皮酚结晶不明显,而垫江所产丹皮内表面丹皮酚结晶明显较多。丹皮酚在水中的溶解度有限,会随着药材中水分散失而挥发,在药材表面附着,析出结晶。在药材表面附着的丹皮酚与空气长时间接触不利于丹皮酚的保留。另外,丹皮在切片的过程中需先将药材润透再切制,这一过程会使药材和水不同程度地接触,若药材表面本身就附着很多丹皮酚结晶,在润药的过程中必定会造成丹皮酚的损失。故丹皮药材表面附着丹皮酚结晶是否越多越好的问题值得商榷。

 

  综上所述,牡丹皮的品质评价研究不够深入,主要利用薄层扫描法和高效液相色谱法对牡丹皮中的主要化学成分进行含量测定,且多数仅测了丹皮酚的含量。牡丹皮栽培品种以白花单瓣者为佳;以安徽铜陵产者为优;采收期以九到十月份为宜;生长年限以四到五年为宜;使用时,以当年采收者为好;加工时应注意去除木心,在低温下切制,新鲜的牡丹皮在产地烘干至一定程度直接切片所生产的牡丹皮不仅外观漂亮,也可保证质量。而对于牡丹皮不同部位,熏硫脱硫,发霉等问题的研究还不够深入。

 

  本研究将采用UPLC-QTOF-MS方法,对牡丹皮中化合成分进行质谱解析,并结合PCA及OPLS-DA数据分析法,对不同产地、不同加工方法(熏硫、晒干)、不同部位化合成分进行分析,同时,运用UPLC-QTRAP-MS-MS法分析不同规格等级、不同产地、不同加工方法(熏硫、晒干)、不同部位主要化学成分含量差异,以期为牡丹皮化学质量评价研究奠定基础;运用Pearson直线相关分析对不同等级牡丹皮化学成分含量与外观性状的相关性进行分析,以期阐明牡丹皮化学成分与外观性状是否具有相关性以及有怎样的相关性关系;对不同等级牡丹皮性状进行测定分析,并制订牡丹皮商品规格等级标准草案。

 

  产地及市场调查

 

  2.1产地调查

 

  2.1.1亳州产区

 

  2017年9月2日至4日,课题组成员实地走访了安徽省亳州市,到田间地头实地查看牡丹皮的田间管理和采收情况,同时到多户药材收购商(家庭小作坊式)存放牡丹皮药材的库房查看牡丹皮的初加工、储藏和等级划分情况。

 

  2.1.1.1产区概况

 

  亳州市位于安徽省西北部,北接河南商丘、西连河南周口,南邻安徽阜阳、东临安徽淮北、蚌埠。位于东经115°53′~116°49′、北纬32°51′~35°05′。亳州全境呈东南西北向斜长形,呈西北高而东南低的地势特点。西北部海拔约42.5米,东南部海拔约22米。全市年均气温14.9℃,年均日照2184小时,平均无霜期213天,平均年降水量831毫米。

 

  2.1.1.2亳州牡丹皮概况

 

  2.1.1.2.1亳州牡丹皮历史概况

 

  亳州栽培牡丹历史悠久,自明代始便有栽培牡丹的记载,但当时的牡丹仅作为观赏牡丹记载于《评亳州牡丹》及《亳州牡丹史》中。至20世纪60年代中期至70年代末期,中草药运动中,凤丹引种到亳州,自引种栽培后,其在亳州蓬勃发展。据了解,现今,亳州市种植药用牡丹近20万亩,种植面积呈逐年递增趋势,且规模化种植趋势明显,农户种植热情持续高涨,当地政府积极推行药材合作社、家庭农场和药企基地大户规模种植模式,以增加药农收入。目前其种植规模已远超重庆垫江和安徽铜陵,亳州牡丹在业界的知名度亦越来越高。

 

  1.1.1.2.1亳州牡丹皮产地加工分级概况

 

  亳州所植药用牡丹规模大,种植历史长,栽培加工技术成熟。采挖时有人工采挖和挖掘机采挖,土地平坦,道路通畅者常采用挖掘机采挖,道路狭窄者,则常人工采挖。亳州产牡丹皮按照加工方法的不同分为连丹皮(黑丹皮)和刮丹皮。抖净泥土后,直接人工去心,或机器开缝去心者,称为连丹皮。趁鲜刮去外皮再去心者,称为刮丹皮。去除木心后,再人工拣选,一般较大者为大选货,较小者为小选货,或者不分大小,称为统货。此外,其产地加工中尚存在熏硫的现象。目前各药材市场所见牡丹皮多数为亳州产牡丹皮。

 

  2.1.2铜陵产区

 

  2016年8月29日至9月1号和2017年3月10日至11日,课题组成员先后两次实地走访了安徽省铜陵市,到田间地头实地查看牡丹皮的田间管理和采收情况,同时到多户药材收购商(家庭小作坊式)存放牡丹皮药材的库房查看牡丹皮的初加工、储藏和等级划分情况。

 

  2.1.2.1产区概况

 

  铜陵市位于安徽省中南部、长江下游,别名定陵、义安,北部与安徽合肥相连,南部接壤安徽池州,东部接壤安徽芜湖,西部与安徽安庆相邻,素有“中国古铜都,当代铜基地”之称。

 

  铜陵位于长江中下游平原与皖南山区的交接地带。属北亚热带湿润季风气候,其特点是季风明显,四季分明,全年气候温暖湿润,雨量丰沛,湿度较大,日照充足,雨热同季,无霜期长。海拔300~500米为主一般坡度都在25°-30°左右,山体比较完整,山势由西南向东北逐渐下降。

 

  2.1.2.2铜陵牡丹皮概况

 

  2.1.2.2.1铜陵牡丹皮历史概况

 

  清·《铜陵县志·古迹》记载:“仙牡丹,长山石窦中有白牡丹一株,高尺余,花二三枝,素艳绝丽。”相传为西晋时期著名炼丹家、医药学家葛洪所种。据考证,仙牡丹与今铜陵大面积种植的药用品种“凤丹白”相似。《铜陵县志》卷十四中有北宋盛嘉佑(石洞村人,今铜陵县董店乡)等人所著《牡丹宅怀古》诗三首。其中有诗载:“筹边持节善怀柔,西夏还辕锡予优。一种名花分御园,九重春色满赢州。”据盛姓花农讲,现今铜陵地区保留种植的“御园红”的重瓣浅红色品种,即是当时皇帝赏赐给他们祖先,以表彰其军功的。按此,铜陵引种栽培牡丹已有近千年的历史[9]。

 

  但以上所载仅为观赏栽培的牡丹品种。唐.《四声本草》[9]:“。。。出和州(今安徽省马鞍山市和县),宣州(今安徽宣城、铜陵市及芜湖部分地区)者并良。”“和州”、“宣州”均位于今安徽东南部地区,包含仅铜陵市。此为铜陵药用牡丹的最早记载。据考证,关于人工栽培牡丹入药的记载,当以明代毫州薛凤翔《牡丹史》为早。据凤凰山药农世代相传的说法,凤凰山真正作为药用的栽培牡丹不过只有五百余年的历史。因其所产牡丹皮,具有条粗长,皮细,肉厚,粉性足,木心少,亮星多,久贮不变色,久煮不发烂的特点,凤丹皮很快以“品质绝佳”而闻名于世,远销东南亚、日本等国。据说,到明崇祯(1628-1644年)年间,凤凰山的牡丹皮生产已具相当规模。曾有“小金銮殿”之称的周氏祠堂,即是当时依靠生产牡丹皮而集资兴建起来的(已在1940年被战火焚毁)。至清代,铜陵“三山”地区(凤凰山、三条冲和南陵县丫山)成为全国著名的牡丹皮主产区。据《铜陵县志》(1757年)和《南陵县志》(1399年)记载,其均将牡丹皮作为主要物产,并贩销到全国各地。同治(1862-1872年)年间,铜陵丹皮紧俏,“凤丹”市价之昂竟至“万斤稻谷易其担”。清末至民国初年,是铜陵历史上牡丹皮生产的鼎盛期,1924-1926年间,年产量曾达14000余担[72]。《增订伪药条辩》(1927年):“产凤凰山者,枝长而条嫩,外用红泥浆过,极易变色,亦佳。产甯国府南陵县木猪山者,名摇丹皮,色黑带红,肉色白起粉者,亦道地。”至今,铜陵产牡丹皮仍被认为品质最佳[14]。

 

  2.1.2.2.2铜陵牡丹皮产地加工及分级概况

 

  铜陵产丹皮采收加工方法比较原始,去心均为人工去心。通常先采挖其根部,抖净泥土带回,略晾晒或不晾晒,剪下根条,直接剥取根皮,较粗状,无法剥者,用小锤轻锤,至皮破后,再剥取牡丹皮。一般药农在边剥皮时,边按粗细及品相分为不同的等级。最粗者称为一条,次粗者称二条,最细者称三条;另外还挑选条匀直,皮细,长度约5-8cm,中部围粗0.6-1cm之间者,称为标二条,为最贵的一种等级,据多家收购商介绍,专供进口;极细无法抽去木心者称为尾根(不符合药典标准);靠近地上部分者,品相差,易碎,称为大头壳(不符合药典标准)。分级后分别晾晒至干燥。铜陵产牡丹皮一般不去皮,不熏硫,抽心率几乎可以达到100%,杂质也较少,一般认为品质较好。除在铜陵本地小型收购户见到铜陵丹皮,在国内各大药材市场均未见到。因此,铜陵产牡丹皮分级情况以在铜陵本地采集样品为基础。

 

  2.1.3垫江产区

 

  2017年1月10日课题组成员实地走访了重庆市垫江县,到田间地头实地查看牡丹皮的田间管理和采收情况,同时到多户药材收购商(家庭小作坊式)存放牡丹皮药材的库房查看牡丹皮的初加工、储藏和等级划分情况。

 

  2.1.3.1产区概况

 

  垫江县,属长江上游地区,位于重庆东北部,地处东经107°13′~107°40′、北纬29°38′~30°31′之间。地貌以丘陵为主,最高海拔1183米,最抵海拔320米,地势北高南低。垫江县属亚热带湿润季风气候,气候温和,雨量充沛,四季分明,春早冷暖多变,夏热常有干旱,秋多连绵阴雨,冬冷无严寒。年均气温17.0℃,无霜期289天。

 

  2.1.3.2垫江牡丹皮概况

 

  2.1.3.2.1垫江牡丹皮概况

 

  牡丹皮始载于《神农本草经》[7],列为中品:“牡丹,一名鹿韭,一名鼠姑。味:辛,寒。生山谷。出巴郡(指今四川、重庆长江与嘉陵江以北地区)”。陶弘景.《名医别录》[9]记载:“生巴郡及汉中”。早在秦汉时期,《神农本草经》及《名医别录》已对垫江丹皮有明确的记载,说明垫江丹皮已有2000多年历史。

 

  始建于南梁大通年间的垫江县新民镇大通寺,当年已把牡丹作为寺花栽培,一种被称为“大通墨玉”的牡丹至今在当地仍有农户种植,按此,其栽培历史有1470年以上[73]。

 

  唐《四声本草》[9]:“今出合州(秦时蜀地,今四川合川市及附近县、市)者佳。白者补,赤者利。出和州(今安徽和县、马鞍山市及附近县、市),宣州(今安徽宣城及其附近县市)者并良。”此时便认为垫江产丹皮质量较佳,后代的历史文献均沿用此说法。

 

  宋代日华子云:“巴(“巴州”、“渝州”秦时具属巴郡,位于今四川、重庆境内。)、蜀(“蜀州”唐时属剑南道,位于今重庆及附近县、市。)、渝(今重庆市境内)、合州(今四川重庆、垫江一带)者上,海盐(今浙江海盐)者次”[9]。苏颂曰:“今出合州者佳,和州、宣州者并良”[9]。

 

  明代《药性粗评》[4]:“生江南川谷,以巴蜀、汉中者为胜。近世出和、滁等州者亦良。”

 

  在当地已发现一些明清时期的古墓及一些古建筑的门窗、床头上亦雕有牡丹图案。另据《垫江乡土志》(中华民国6年版)记载:“本境货牡丹皮远销重庆、达县等地,年值银数百两。”民国7年(1918)县外商人在今垫江太平镇设点收购粉丹皮、原丹皮。《垫江县志》[74]记载:民国15年粉丹可换黄谷1石(162kg)。说明垫江县牡丹种植历史悠久,且种植目的是生产丹皮供药用,牡丹文化在垫江县特别是明月山一带早已深入人心。川丹皮历史沿革见附录。

 

  2.1.3.2.2垫江牡丹皮药材产地加工及分级概况

 

  垫江牡丹皮加工去心均为人工去心。通常先采挖其根部,抖净泥土带回,略晾晒或不晾晒,剪下根条,直接剥取根皮,较粗状,无法剥者,用小锤轻锤,至皮破后,再剥取牡丹皮。一般按照加工方法分为连丹皮和刮丹皮,刮丹皮和连丹皮规格规格下,又按照粗细分为选货和统货。因目前垫江药用牡丹皮的种植受观赏牡丹高利润的冲击,产量逐年下降,商品量较少,除了在重庆解放路药材专业市场及荷花池药材市场见过少量出售,其他药材市场均未见垫江牡丹皮商品。因此,本次牡丹皮药材商品规格等级标准制订时未将川丹皮单列为一个规格。

 

  2.2市场流通情况调查

 

  市场牡丹皮药材规格划分概况:牡丹皮药材主要为安徽亳州产牡丹皮,依据加工方法的不同,分为连丹皮和刮丹皮。除此以外,市场山尚存在许多熏硫丹皮,熏硫丹皮通体色白,有酸味。在各大药材市场流通牡丹皮以片为主,药材不多见。

 

  市场牡丹皮药材等级划分概况:市场上牡丹皮药材主要依据牡丹皮直径大小、抽心率、含杂率等划分为大选货、小选货、大统货、小统货和统货。不同药材市场,不同商户间对不同等级的牡丹皮的称呼有所不同;除牡丹皮药材外,牡丹皮片的分级更为复杂,根据大小、抽心率、杂质含量等,亦有大选片、小选片、大统片、小统片、统片。

 

  2.2.1亳州药材市场

 

  2.2.1.1亳州药材市场概况

 

  亳州康美中药城为全国最大的中药材交易市场,自2013年11月24日正式开业以来,其交易额日益攀升。其规模宏大,占地387亩,建筑面积35万平方米,拥有1000家中药材经营店面。3.2万平方米的交易大厅有摊位6000余个;办公主楼建筑面积约7000平方米,内设中华药都投资股份有限公司办公机构、大屏幕报价系统、交易大厅电视监控系统、中华药都信息中心、优质中药材种子种苗销售部、中药材种苗检测中心、中药材饮片精品超市等。各地客商云集,品种丰富。

 

  2.2.1.2亳州药材市场牡丹皮商品规格等级划分概况

 

  2016年6月1日至6月5日课题组成员赴亳州药材市场对牡丹皮药材进行市场调查,亳州药材市场所售牡丹皮均为亳州产牡丹皮。且市场上牡丹皮药材较为少见,多为牡丹皮片。牡丹皮药材按照是否去皮分为原丹皮和刮丹皮,再按照直径大小分为选货、统货。选货又依据求购商的需求分为直径大小不同的大选货和小选货。此外,市场上尚存在大量熏硫及抽心率不符合《中国药典》规定的牡丹皮药材及牡丹皮切片。

 

  2.2.2安国药材市场

 

  2.2.2.1安国药材市场概况

 

  河北安国东方药城是国家认定的17家中药材专业市场之一,被评为全国百强市场第2名,是中国北方最大的中药材专业市场。该市场占地1.5平方公里,建筑面积约60万平方米,分上下两层,内有药商门店780余户。

 

  2.2.2.2安国药材市场牡丹皮药材规格等级划分概况

 

  2016年4月14日至15日课题组成员赴河北安国药材市场对牡丹皮药材进行市场调查,安国药材市场仅有牡丹皮片,罕有牡丹皮药材。且每家每户经营牡丹皮片的规格等级划分较为单一,有的仅有统货,有的仅有选货。

 

  2.2.3四川荷花池药材市场

 

  2.2.3.1四川荷花池药材市场概况

 

  成都荷花池中药材专业市场是全国17个国家级大型中药材专业市场之一,全国第三大药材市场,是西部地区规模最大,品种最多的大型综合批发市场。

 

  2.2.3.2四川荷花池药材市场牡丹皮药材商品规格等级划分概况

 

  2017年1月11日课题组成员赴成都荷花池药材市场对牡丹皮药材进行市场调查。成都荷花池药材市场所售牡丹皮多为亳州产牡丹皮,亦有垫江产牡丹皮,垫江产牡丹皮售价较贵。按照产地分为亳州货和垫江货,按照直径大小、破碎度分为特级、选货和统货。按照其是否刮皮分为连丹皮和刮丹皮。此外,荷花池药材市场尚存在大量熏硫及抽心率低的牡丹皮药材及牡丹皮片,主要来自亳州栽培品。

 

  2.2.4广西玉林中药材专业市场

 

  2.2.4.1广西玉林中药材专业市场概况

 

  玉林市中药材专业市场是经国家卫生部、国家医药局、国家中医药局、国家工商局首批获准开办的全国17家中药材市场之一,亦为广西唯一的中药材专业市场。该市场于1988年4月兴建,同年12月开业,总投资441万元,占地面积28亩,建筑面积上下两层共1.45万平方米,有门店812间,现有经营户809户。

 

  2.2.4.2广西玉林中药材专业市场牡丹皮药材商品规格等级划分概况

 

  2017年11月19日至21日,本课题组成员赴广西玉林中药材专业市场对牡丹皮药材进行市场调查。玉林中药材专业市场牡丹皮仍然以丹皮片居多,药材较少见,且多为亳州产牡丹皮。牡丹皮药材按照是否去皮分为原丹皮和刮丹皮再按照直径大小、抽心率高低和杂质多少分为大选货、小选货和统货。还有各种熏硫及抽心率低的牡丹皮药材及牡丹皮片。

 

  2.3牡丹皮药材性状数据测定及数据分析

 

  因铜陵牡丹皮与其他产地牡丹皮外观性状差异较大,自古以来均被称为道地药材,且栽培、种植、加工较规范。故将铜陵牡丹皮单独划分为一个规格。其他产地的牡丹皮有刮丹皮和原丹皮之分,故将其他产地的牡丹皮分为刮丹皮和原丹皮两个不同的规格。

 

  铜陵牡丹皮药材未见在各药材市场流通,因此铜陵牡丹皮药材分级以铜陵产地所收集的样品为准。其他产地牡丹皮药材规格等级标准制订以产地及药材市场采集的牡丹皮样品为准。

 

  对产区随机进行多点取样,收集不同农户各规格等级牡丹皮药材,并对其进行性状数据测量,每份样品随机取10个个体并用游标卡尺测量牡丹皮药材最粗处外径、内径、皮部厚度,用直尺测量牡丹皮药材的长度,用天平测量每个个体的质量。因每家每户划分稍有差异,称呼不同,因此用Excel表格先对各测量量的最大值、最小值及均值进行粗略统计,将样品差异不大的归为一类,再用SPSS软件进行频数分析。

 

  2.3.1铜陵牡丹皮性状数据处理

 

  利用SPSS软件,对所有直径与长度的数据进行非参数的K-S检验,发现长度、外径、内径、皮部厚度测定数据符合正态分布,而铜陵三条个体质量数据不符合正态分布。为了所有数据的均一性,利用正态分布曲线求出每组数据均值99%置信水平的置信区间(统一置信水平,避免主观因素的影响,结果见表2-1),作为不同等级的限定范围。

 

  把所有铜陵产不同等级的牡丹皮药材的长度、外径、内径、皮部厚度及个体质量的测定数据进行单样本T检验,设置置信区间百分比为99%,计算不同等级牡丹皮的长度、外径、内径、皮部厚度的上限和下限。由置信区间计算出的各等级性状数据分布范围如表2-2所示。各不同等级牡丹皮频数分布图见图2-1至图2-4。

 

  综合考虑牡丹皮药材的长度、外径、内径、皮部厚度的数值及对牡丹皮药材等级划分的影响,将四个因素的权重设定为:外径>长度>内径>皮部厚度。

 

  2.3.2其他产地牡丹皮药材性状数据测定及数据分析

 

  其他产地牡丹皮药材性状数据测定及数据处理同铜陵牡丹皮。单样本Kolmogorov-Smirnov检验结果见表2-3,由置信区间计算出的各等级性状数据分布范围如表2-4所示。各不同等级牡丹皮频数分布图见图2-5至图2-8。

 

  2.4本章小结

 

  从市场上采得的牡丹皮的外观性状上看,结合《中国药典》对牡丹皮外观性状的要求,初步制订牡丹皮药材商品规格等级草案。

 

  备注:

 

  当前市场上所售丹皮多数为亳州所产丹皮,一般认为铜陵丹皮质量最佳,价格最高,在产地铜陵地区划分规格等级较细且较为统一,多出口,市场上未见有售;垫江丹皮仅受观赏丹皮高利润的冲击,产量逐渐萎缩,量较少。铜陵产凤丹皮一般不刮皮,其他产地丹皮尚存在连丹皮和刮丹皮两种规格。

 

  市场上尚存在大量熏硫牡丹皮,表面色白,有酸味,应注意区分。

 

  (3)市场上还存在加工成片(大量)或段(少量)的牡丹皮,这些丹皮片或段,粗细不一,多数抽心率低,均不符合《中国药典》对丹皮药材的规定,应注意区分。

 

  (4)市场上丹皮商品规格等级划分比较随意,一般都是根据客户的需求,再按照大小来挑选,如铜陵有种等级为标二条,又称二标,专供出口用,要求条匀直,皮细,直径0.5-1cm之间,长度不低于3cm。

 

  基于UPLC-QTOF-MS的牡丹皮化学成分化学成分分析

 

  牡丹皮为毛茛科植物牡丹Paeonia suffruticosa Andr的干燥根皮,用药历史悠久,具有很高的药用价值。其味苦、辛,微寒。归心、肝、肾经。有清热凉血,活血化瘀之功效。用于热入营血,温毒发斑,吐血衄血,夜热早凉,无汗骨蒸,经闭痛经,跌扑伤痛,痈肿疮毒[1]。现代研究表明牡丹皮主要化学成分为酚类及酚苷类、单萜及单萜苷类,其他成分还有三萜、甾醇及其苷类、黄酮、有机酸、香豆素等[2]。现代药理研究表明其药理作用主要有抗炎、抗菌、对心血管系统的调节作用、中枢抑制作用、免疫调节功能等[2]。目前关于牡丹皮化学成分相关研究较多,但系统的化学成分的研究较少,本研究拟采用UPLC-Q-TOF-MS技术对牡丹皮中的化学成分进行系统鉴别分析,为牡丹皮的进一步研究提供参考。

 

  3.1实验材料与仪器

 

  ACQUITY I-Class超高效液相色谱仪-Waters Xevo-G2-S Q-TOF MS质谱系统(美国Waters公司)。Waters ACQUITY UPLC-T3-C18S色谱柱(2.1 mm×100 mm,1.7μm,美国Waters公司)、BSA224S型万分之一分析天平(德国Sartorius公司)、Centrifuge 5415D型离心机(德国Eppendorf公司)、SB-800-DTD型超声清洗机,超声功率500 W(宁波新芝生物科技股份有限公司)、Pacific T-Ⅱ型超纯水仪(美国Thermo公司)。水为超纯水,甲醇,乙腈为色谱纯(德国Merck公司),其余试剂均为分析纯,0.22μm hydrohpobic疏水PTFE微孔滤头(美国Millipor公司)。

 

  对照品有OP(氧化芍药苷)、P(芍药苷)、BP(苯甲酰芍药苷)、BOP(苯甲酰氧化芍药苷)、GM(没食子酸甲酯)、GA(没食子酸)、Alb(芍药内酯苷)、PentaG(1,2,3,4,6-五没食子酰葡萄糖苷)、PX(丹皮酚新苷)、PY(丹皮酚原苷)、Paeonol(丹皮酚),纯度均≥98%,购买于荣诚鑫徳科技发展有限公司。

 

  牡丹皮样品:7株牡丹皮鲜样为2017年4月本文作者赴安徽亳州采挖所得,熏硫牡丹皮药材为2016年5月至2017年10月由本文作者从亳州、铜陵、垫江各牡丹皮产地及河北安国药材市场、亳州药材市场、成都荷花池药材市场采得。

 

  3.2实验方法

 

  供试品溶液的制备:取丹皮药材,将其粉碎,过药典三号筛,精密称取药材粉末0.2 g置2mLEP管中,精密加入80%甲醇1.6 mL,超声(功率500 w)提取90min,放至室温。样品用13000 r/min离心20 min,取上清液,过0.22μm的微孔滤膜,供分析用。

 

  对照品溶液的制备:精密称取适量各种对照品约1mg,置于10 mL容量瓶中,加适量甲醇超声使其溶解,放至室温,再加甲醇至刻度,摇匀,精密取各混合对照品溶液(除丹皮酚新苷和没食子酸)各0.1mL,混匀,过0.22μm疏水PTFE微孔滤头过滤得混合对照品1。另取丹皮酚新苷和没食子酸对照品溶液稀释各0.1mL,稀释5倍,得混和对照品2.

 

  3.3实验结果

 

  3.3.1化学成分质谱解析

 

  为了更全面地获得药材中所含的化合物的信息,对提取溶剂、色谱条件、质谱条件等进行了优化,选择最优条件对牡丹皮药材及对照品供试液进行LC-MS分析。其中负离子模式下显示出更为丰富的信息。为了更好地对牡丹皮中化学成分进行鉴定,首先选择了芍药属中所含化学成分的一些对照品,并对这些对照品进行裂解规律的探索,根据裂解碎片及相关资料推测可能的裂解途径,确定各对照品的色谱保留时间。对供试品进行UPLC-Q-TOF-MS分析,将数据导入Masslynx4.1软件中自带的数据库以及Chemspider(http://www.chemspider.com/)及Scifinder(https://scifinder.cas.org/)得到可能的分子式及候选化合物。根据二级质谱碎片及标准品裂解规律,结合DAD特征光谱与化合物ClogP值等信息,以及芍药属已报道的相关研究进行成分鉴定。以Q-TOF-MS给出的碎片信息与数据库进行比对,牡丹皮样品在Q-TOF-MS上常见碎片如图3-1,结合如下各种类化合物裂解规律对相关化合物进行结构解析。

 

  4.3.1.1芍药苷类

 

  芍药苷类成分都具有一个笼状的单帖母核结构,在其3号位上通常与糖成苷,其10号位上通常与含有苯环的有机酸形成酯键,6号位上通常连有羟基、甲氧基或其他基团,在糖的6号碳上有时又会和其他含苯环的有机酸(如苯甲酸)形成酯苷。在质谱中较易形成[M+HCOO]-,[M+Cl]-的加和峰,[M-H]-也较明显,如芍药苷,具有525.16[M+HCOO]-,515.13[M+Cl]-的加和峰。此类成分最终会形成分子量为165.05的单帖母核碎片(丹皮酚苷类成分也会产生与其分子量一样的碎片,但丹皮酚苷类成分碎片中还有150.03,122.03,89.02),此外还有一些与苯甲酸类成分相关的碎片,如HB(121.03,101.02),B(137.02,93.03),VA(167.03),G(169.01,125.02,107.01)。在该类成分中一般最容易先失去与糖相连接的基团,然后失去失去10号位上连接的苯甲酸基团,最后断开单萜母核与葡萄糖之间的苷键[75]。芍药苷裂解规律如图3-4所示。本研究中共鉴定出芍药苷类化合物27个。

 

  4.3.1.2丹皮酚苷类

 

  丹皮中的丹皮酚苷类成分在质谱中通常有165.05的丹皮酚母核结构,通常在其酚羟基上链接一个单糖,糖上有时另外连接单糖或其他没食子酰基。丹皮酚在本次建立的UPLC-QTOF-MS中响应很低,但其相应的苷类成分较容易离子化,而在质谱中有较高响应。其分子离子峰在其一级质谱中还有丰富的加和峰[M+Cl]-,[2M-H]–和[M+HCOOH]–。galloylsuffruticoside D裂解规律如图3-5.

 

  化合物93的准分子离子峰为m/z 763.17[M-H]-,二级质谱为611.16,597.11,579.09,445.10,381.08,343.06,169.01,125.02,除了具有失去没食子酰基的碎片m/z[M-152]-与化合物suffruticoside D有相同的质谱裂解规律和相似的紫外吸收,故推测其应为suffruticoside D的糖与没食子酰基成苷。此化合物为首次在芍药科植物中发现。与其结构类似的还有化合物96,98,100,102分别鉴定为galloylsuffruticoside C及其同分异构体galloylsuffruticosideA,B。这五种化合物均首次在芍药属植物中报道。

 

  4.3.1.3可水解鞣质类

 

  牡丹皮中的没食子酸鞣质通常是由没食子酸与葡萄糖通过甙键或酯键而形成的化合物。此类成分,除具有明显的[M-H]-,还具有明显的(M-2H)/2峰,在裂解的过程中连续中性丢失没食子酸及邻三羟基苯的中性碎片。此类成分在裂解的过程中会产生许多连续失去152Da和170Da的碎片。这些化合物会产生许多与没食子酸基团相关的碎片169.01,125.01,123.01。1,2,3,4,6-五没食子酰葡萄糖裂解规律如图3-6。

 

  4.3.1.4缩合鞣质

 

  牡丹皮中的缩合鞣质是一类由儿茶素及其衍生物棓儿茶素等黄烷-3-醇类化合物以碳-碳键聚合而形成的化合物。此类成分通常可失去整片的儿茶素或棓儿茶素碎片。原花青素C1裂解规律如图3-7。化合物38和39鉴定为原花青素B3或其同分异构体。他们均具有m/z 577.13[M-H]—的准分子离子峰,在其二级质谱中还有289.07,245.08,203.07,137.02,109.03的峰,这些二级质谱碎片均为儿茶素二级质谱裂解碎片一致。因表儿茶素二聚体具有较多的同分异构体,因此无法确定其具体的结构。

 

  化合物46的准分子离子峰为m/z 865.20[M-H]—,分子式为C45H38O18,除[M-H]—以外,其具有与化合物38,39相同的二级质谱碎片(577.134 289.07,245.08,203.07,137.02,109.03)和相似的紫外吸收。根据其质谱裂解规律推测其为原花青素C,化合物47和化合物69具有与此相似的质谱裂解碎片,因此推断其分别arecatannin A-1或其同分异构体。化合物38,39,46,47,69均首次在芍药科植物中发现。

 

  4.3.1.5芍药苷亚硫酸酯类裂解规律

 

  芍药苷亚硫酸酯类,仅在熏硫及脱硫样品中检出,与芍药苷类成分具有相似的结构,仅在6号碳上有差别,芍药苷类是羟基,而芍药苷亚硫酸酯类为亚硫酸基团。m/z 80.96,m/z 259.03 and m/z 213.02均代表其含硫的单萜母核结构,其中m/z 259.03响应较高,而其他碎片于芍药苷类成分类似,因此,将m/z 259.03导入到Masslynx V4.1中,搜索所有相关化合物。

 

  化合物29准分子离子峰均为m/z 591.10[M-H]—,与C23H27O16S具有94.69%的匹配度,碎片峰169.01和125.02代表化合物中含有没食子酰基基团,而259.0293,80.9639代表此化合物中具有含硫单萜母核,其他二级质谱碎片与6'-O-galloyl desbenzoylpaeoniflorin相同,故化合物29被鉴定为6'-O-galloyl desbenzoylpaeoniflorin sulfonate,为熏硫牡丹皮样品中新产生的化合物。

 

  同样的,化合物45,52,64,73,90,92,94被鉴定为mudanpioside D sulfonate,galloyloxypaeoniflorin sulfonate,galloylpaeoniflorin sulfonate,mudanpioside H sulfonate,mudanpioside C sulfonate,benzoyloxypaeoniflorin sulfonate,和mudanpioside B sulfonate。他们均与其对应的芍药苷类成分具有相同的质谱裂解碎片和相似的紫外吸收,这些化合物均为熏硫牡丹皮样品中新产生的化合物。所有化合物解析结果详见表3-3,部分化合物在图4-1中标出。

 

  标“*”的化合物为使用标准品比对的的化合物;标“#”的化合物为新化合物;标“®”的化合物的熏硫过程中产生的新化合物

 

  “*”means the compound was identified by comparing with standard compound;“#”means new compound reported for the first time;“®”means the compound produced in sulfuring process

 

  3.4本章小结

 

  本章首次运用超高效液相色谱串联四极杆飞行时间质谱技术对牡丹皮中化学成分质谱裂解规律进行总结,并对牡丹皮所含化合物进行系统解析。主要依据质谱裂解规律、精确分子量,参考芍药属化学成分的研究及天然产物数据库搜索等方法,并采用化物的Clogp值对其同分异构体进行了有效区分,共鉴定出122个化学成分。

 

  熏硫及脱硫前后化学成分差异分析

 

  熏硫作为一种常用的中药材产地加工方法,已有100多年的历史。《温县志》中首次记载了光山药的熏硫加工方法[107],其后民国时期的《药物出产辨》[108]中记载了天花粉、平贝母等常用中药在产地加工中均使用硫磺熏蒸的现象。但其中明确指出熏硫中药质量差,“平贝母。。。以西贝为最劣,因其出新时用灰水盐水浸过,使其胶汁尽出。贪其色,不顾其精,致其味变酸、咸。如此劣品,应在早日淘汰之。”“花粉。。。及(又)名栝蒌根,医生用治咳症,以为可以除痰清热,熟料制造花粉者,不惜硫磺工本,熏至质味转酸,不独无益,而又害之。”其后《鉴选国药常识》[109]等多本中药相关书籍中均提到熏硫加工会降低中药质量。该书封尾郑重声明:“本堂(灵学会盛德堂药号,该书作者单位)发售饮片只求道地,不尚美观使保全国药天然性质,凡经硫磺熏过之药,一概不用,以免贻害病家,特此郑重声明诸希公鉴”。2015版《中国药典》中还规定了山药、天冬等10味中药的二氧化硫残留量限定标准。但熏硫在中药干燥、防霉、防蛀等方面所表现出的优势,使其在实际生产中屡禁不止。甚至,为防止已熏硫中药在抽检过程中二氧化硫残留量不超标,出现了熏硫药材脱硫的现象。

 

  现代研究表明,中药熏硫会使中药中许多化学成分转化为其他的化合物[78,101,110-115]。一方面,熏硫导致的二氧化硫、亚硫酸及其对应的盐可能与中药中某些化学成分特异性结合产生新的化合物;另一方面,熏硫导致的酸性环境可能导致中药中某些易水解的化合物水解而转化为其他化合物。而脱硫经常采用的方法是使用强氧化剂将中药中二氧化硫、亚硫酸及其对应的盐氧化,氧化为不可被检测的硫酸盐类。这个过程中常将中药材浸泡在脱硫剂溶液中,这必将导致易氧化化学成分及水溶性化学成分的含量的降低。而化学成分的改变必将导致临床疗效的差异。

 

  牡丹皮为毛茛科植物牡丹Paeonia suffruticosa Andr.的干燥根皮[2],其在产地加工中也存在熏硫加工的现象。单萜苷类、没食子酸苷类、丹皮酚苷类等是其主要化学成分,其中单帖苷类是芍药属植物特有成分[78]。据报道牡丹同属植物白芍中单帖苷类成分在熏硫的过程中转化为含硫化合物[116],因此牡丹中可能也存在类似的变化,而目前相关研究较少,而脱硫剂的使用对中药材中化学成分的影响尚未引起关注。本章主要运用超高效液相串联飞行时间质谱仪(UPLC-QTOF-MS)对牡丹皮中化学成分进行了详细的质谱解析,代谢组学分析方法对熏硫、脱硫过程中化学成分的变化进行了系统分析;运用超高效液相-四极杆-线性离子阱质谱(UPLC-QTRAP-MS/MS)测定了正常、熏硫、脱硫牡丹皮中主要10种化学成分的含量,并对熏硫、脱硫过程中主要化学成分含量的变化及其与熏硫程度之间的关系进行了分析;运用中国药典硫酸蒽酮法和二氧化硫残留量测定法对样品中多糖含量进行了测定。以期为丹皮质量的控制提供参考依据,为其他熏硫、脱硫药材的深入研究提供新的思路。

 

  4.1实验材料与仪器

 

  实验仪器:ACQUITY I-Class超高效液相色谱仪-Waters Xevo-G2-S Q-TOF MS质谱系统(美国Waters公司)、ACQUITY I-Class超高效液相色谱仪(美国Waters公司)-QTRAP-MS 6500四极杆-线性离子阱质谱仪(美国ABSCIEX公司)。

 

  实验试剂:同第三章。

 

  牡丹皮样品:7株牡丹皮鲜样为2017年4月本文作者赴安徽亳州采挖所得,不同熏硫程度的牡丹皮药材为2016年5月至2017年10月由本文作者从亳州、铜陵、垫江各牡丹皮产地及河北安国药材市场、亳州药材市场、成都荷花池药材市场采得。

 

  4.2实验方法

 

  4.2.1实验材料前处理

 

  4.2.1.1牡丹皮鲜样熏硫

 

  取牡丹皮鲜样7株(Z1-Z7),去除木心,每株分为两份,一份正常晾干,另一份放入大塑料箱(提前留好气孔5个),点燃硫磺,盖上盖子,直至火苗熄灭,将气孔封上,密闭12小时,取出,晾干,得熏硫药材SM11-SM17。

 

  4.2.1.2含硫量不同的牡丹皮药材的脱硫处理

 

  取市场上所购得的不同含硫量的牡丹皮药材10份,每份均分为二,一份留作对照,另一份按照1:4的比例浸入含京百灵10%的溶液中,2小时后取出。另取同一份熏硫药材分为三份,将其浸入水中,2小时后取出,验证脱硫后化学成分的减少是否是脱硫剂导致的。将所有相关药材放入冻干机中,冻干,得到熏硫药材SM201-SM210,脱硫药材DSM01-DSM10。

 

  4.2.2 Q-TOF-MS方法

 

  同第三章。

 

  4.2.3 Q-TRAP-MS-MS方法

 

  4.2.3.1仪器方法

 

  液相条件:见表4-1。

 

  质谱条件:离子源:Turbo V;电离模式:ESI-;离子化温度(TEMP):550℃;采集方式:MRM。优化的条件参数见下表4-2。

 

  4.2.3.2供试品及对照品溶液的制备

 

  供试品溶液的制备:精密称取样品粉末0.02g,加入2mL甲醇溶液(70%),超声30min,12000rmp离心10min,取上清液1mL,加入70%甲醇溶液定容至10mL,过0.22μm的微孔滤膜,供分析用。

 

  混合对照品溶液的制备:精密称取没食子酸甲酯3.90mg,苯甲酰芍药苷2.21mg,丹皮酚4.32mg,丹皮酚新苷3.99mg,芍药苷2.84mg,苯甲酰氧化芍药苷2.94mg,1,2,3,4,6-五没食子酰葡萄糖苷6.01mg,丹皮酚原苷2.58mg,没食子酸2.27mg,氧化芍药苷4.43mg,分别加入1mL甲醇使溶解。精密取各标准品溶液各100µL,定容至2mL,得混合对照品。

 

  4.2.3.3方法学考察

 

  线性关系考察:将2.2.2所得混合对照品分别稀释1.5,2,5,10,15,25,50,100,150,200,500,10000,1500,2000,5000倍,得不同浓度的混合对照品溶液,按照2.2.1项下色谱及质谱条件测定峰面积。以对照品浓度X(µg/mL)为横坐标,峰面积Y为纵坐标绘制标准曲线。各化合物标准曲线、线性相关系数及线性范围如表4-3所示。(因样品中没食子酸甲酯、苯甲酰芍药苷、丹皮酚新苷、丹皮酚原苷、芍药苷的含量分布范围较宽,无法用同一条标准曲线定量,故对这几种化合物作了两条标准曲线,并在相应的线性范围内计算样品中化合物的含量。)

 

  精密度试验:精密吸取同一混合对照品溶液,连续进样6次,分别计算各对照品的峰面积的RSD%值,如表4-3,表明仪器精密度良好。

 

  重复性试验:取同一份样品粉末6份,按照“2.2.2”项方法制备供试品溶液,进行测定,分别计算待测组分的质量分数的RSD%值,结果如表4-3,表明方法重复性良好。

 

  稳定性试验:取同一份供试品溶液于12h,24h,36h,48h,60h,72h进行测定,计算待测组分含量的RSD%值,结果如表4-3,表明供试品溶液在3d内稳定性良好。

 

  4.2.4二氧化硫残留量测定

 

  SO2残留量测定方法见中国药典第四部通则2331。对脱硫前后牡丹皮药材中SO2残留量进行测定。

 

  4.3实验结果

 

  从图4-1中可以看出熏硫后牡丹皮中多种化学成分的种类发生了变化,而脱硫药材中化学成分的含量普遍降低。

 

  4.3.1代谢组学分析

 

  将所获得的质谱数据导入到QI软件中,因负离子模式下,可获得丰富的离子碎片,因此采用负离子模式进行P2CA模式识别,见图4-3 A,从图中可以看出正常、熏硫、脱硫样品完全分离,同类型样品很好地聚在同一区域。在PCA分析基础上,借助于OPLS-DA对数据进行两维数据分析,从而得到牡丹皮数据散点图。正常-熏硫散点图见图4-3B;熏硫-脱硫散点图见图4-4B。选取VIP>10的化合物作为备选差异成分,正常-熏硫差异成分相对含量见图4-3C/D;脱硫后含量显著降低的差异成分相对含量见图4-4C。熏硫过程中相关差异成分结构式及其可能发生的转化关系见图4-3E;脱硫前后差异成分结构图见图4-4D。选取VIP>4的差异成分,比较其在正常、熏硫、脱硫样品中相对含量差异。正常、熏硫、脱硫样品中差异成分堆积图见图4-5。

 

  4.3.2 Q-TRAP-MS-MS定量分析结果

 

  4.3.2.1熏硫对牡丹皮中化学成分的影响

 

  牡丹皮经熏硫后,其中的苯甲酰芍药苷、苯甲酰氧化芍药苷及丹皮酚的含量极显著降低(P<0.05);丹皮酚新苷及丹皮酚原苷的含量极显著升高(P<0.05);芍药苷及1,2,3,4,6-五没食子酰葡萄糖苷的含量显著升高(P<0.1);而氧化芍药苷及没食子酸甲酯的含量略有升高,但两组差异不明显;没食子酸的含量变化不大。熏硫前后化学成分含量见图4-6.

 

  **在0.05水平(双侧)上相关

 

  *在0.1水平(双侧)上相关

 

  4.3.2.2脱硫对熏硫牡丹皮化学成分的影响

 

  熏硫牡丹皮经脱硫处理后,除没食子酸、1,2,3,4,6-五没食子酰葡萄糖苷的含量显著降低以外,其他8种化学成分的含量均不同程度地降低。其中SO2残留量降低最明显;脱硫前,牡丹皮中SO2的含量均高于172mg/kg,均值为618 mg/kg,最大甚至达到843 mg/kg,而2015版《中国药典》规定除另有规定外,药材及饮片(矿物类除外)的二氧化硫残留量不得过150mg/kg。这些在市场上所购得的牡丹皮药材中SO2残留量均高于药典要求,脱硫处理后,SO2残留量均符合《中国药典》规定。熏硫前后化学成分的含量见图4-7.

 

  ***两组间存在极显著差异

 

  **两组间存在显著差异

 

  *两组间存在差异

 

  4.3.3 SO2残留量测定结果及其与次生代谢产物相关性分析

 

  SO2残留量测定结果如图4-8所示。由图中可以看出,从各药材市场所购牡丹皮中SO2残留量均超过《中国药典》规定,有的甚至高达1440ug/kg,脱硫处理后,SO2残留量显著降低,均能符合《中国药典标准》。说明脱硫剂的使用确实可降低熏硫牡丹皮中SO2残留量。运用SPSS软件对熏硫及脱硫牡丹皮中次生代谢产物的含量与SO2残留量做双变量相关性,结果表明:SO2残留量与丹皮酚的含量呈极显著正相关关系,与没食子酸甲酯的含量呈极显著负相关关系,与芍药苷及氧化芍药苷的含量显著正相关,与1,2,3,4,6-五没食子酰葡萄糖苷的含量显著负相关。

 

  4.4本章小结

 

  在熏硫的过程中,牡丹皮中共有15种含硫化合物产生,均为芍药苷类成分的6号碳上的羟基被硫酸酯化。同时,熏硫造成的酸性环境加速了初级苷类成分的水解,含量降低,而次级苷的含量升高。与熏硫样品相比,脱硫样品中多数化学成分的含量降低了,化合物81甚至无法检出。

 

  同时建立了牡丹皮中10种化学成分的含量测定方法,测定了正常、熏硫、脱硫牡丹皮中化学成分含量的差异。牡丹皮经熏硫后,牡丹皮中芍药苷及氧化芍药苷的含量均升高,而苯甲酰芍药苷及苯甲酰氧化芍药苷的含量均降低。研究表明芍药中芍药苷类成分在熏硫的过程中会转化为芍药苷亚硫酸酯类成分[116],而牡丹皮中亦含有芍药苷类成分,理论上,熏硫后牡丹皮中芍药苷及氧化芍药苷类成分的含量应当降低。本研究的结果却表明芍药苷及氧化芍药苷类成分熏硫后含量升高,说明其在转化为芍药苷亚硫酸酯类的同时,其他芍药苷类成分如Mudanpioside A、4-O-butylpaeoniflorin、4-O-ethylpaeoniflorin、4-O-methylgalloyloxypaeoniflorin等可能水解转化为芍药苷及氧化芍药苷,导致其含量升高。而苯甲酰芍药苷及苯甲酰氧化芍药苷的含量的均降低了,一方面可能是其转化为芍药苷亚硫酸酯类成分,另一方面,可能是熏硫导致的酸性环境使其水解。丹皮酚新苷及原苷的含量在熏硫的过程中均升高了,可能是由于丹皮中Suffruticoside A、B、C、D等成分水解。

 

  熏硫牡丹皮经脱硫处理后,除没食子酸、1,2,3,4,6-五没食子酰葡萄糖苷的含量显著升高以外,其他8种化学成分的含量均不同程度地降低。其中SO2残留量降低最明显;脱硫前,牡丹皮中SO2的含量均高于172mg/kg,均值为618 mg/kg,最大甚至达到843 mg/kg,而2015版《中国药典》[2]规定除另有规定外,药材及饮片(矿物类除外)的二氧化硫残留量不得过150mg/kg。这些在市场上所购得的牡丹皮药材中SO2残留量均高于药典要求,说明熏硫很容易导致SO2超标。在测定熏硫牡丹皮中SO2的含量时,脱硫剂的使用对SO2含量测定有掩盖作用,因为京百灵中CLO2在水溶液中加热的条件下会产生次氯酸,使变红的甲基红乙醇溶液褪色,从而使测定结果偏低。由此可看出,脱硫确实可以降低牡丹皮中SO2残留量,同时脱硫会使牡丹皮中许多次生代谢产物含量降低。

 

  由此可知,熏硫加工会导致牡丹皮中次生代谢产物含量的变化,有些成分含量升高,有些成分含量降低。而脱硫在降低SO2残留量的同时,也会导致牡丹皮中许多化学成分含量降低,这些化学成分含量的变化必然导致临床疗效的改变,因此,在尚未弄清其中化学成分的转化关系及化学成分的转化量与熏硫程度之间关系,新产生的化合物的药理和毒理作用不明,且无法控制硫熏程度的情况下应尽量不熏硫;而脱硫会使牡丹皮中多种化学成分的含量降低,会使牡丹皮药材质量进一步降低,应禁止使用。不同产地牡丹皮差异成分分析

 

  “道地药材”是指在特殊自然条件、生态环境内所产的药材,且生产较为集中,栽培技术、采收加工也都有讲究,以致较同种药材在其他地区所产者品质佳、疗效好、为世所公认而久负盛名者[117]。《神农本草经》[7]曰:“土地所出,真伪新陈,并各有法”。此后,历代医家,如:陶弘景、李时珍、陈嘉谟等在评价中药材质量时也十分强调中药的道地性[5,7,8]。传统推崇的道地牡丹皮有凤丹皮和川丹皮,而亳丹皮由于栽培历史长,产量大,产地加工相对统一,也逐渐得到了认可。凤丹皮是指产于安徽铜陵凤凰山及周边地区的牡丹皮,而川丹皮是指产于重庆垫江、灌县及其周边地区的牡丹皮,自古以来就被视为道地药材。牡丹皮始载于《神农本草经》[7]:“牡丹,一名鹿韭,一名鼠姑。味:辛,寒。生山谷。出巴郡(指今四川、重庆长江与嘉陵江以北地区)”。唐.《四声本草》[9]:“今出合州者佳。。。出和州(今安徽省马鞍山市和县),宣州(今安徽宣城、铜陵及芜湖部分地区)者并良。”唐时期“合州”位于四川合川市及附近县、市,而“和州”、“宣州”均位于今安徽东南部地区。宋、明、清时期的本草学著作对铜陵及垫江产牡丹皮均有提及[9,10,14]。亳州药用牡丹皮栽培最早始于清代,清《得配本草》[4]记载:“川生者,内外俱紫,治肝之有余。亳州生者,外紫内白,治肝之不足”,目前其栽培规模及已远远超过川丹皮和凤丹皮。

 

  由于不同栽培地区的生态环境、加工方式等存在差异,不同道地产区牡丹皮外观性状上略有差别:凤丹皮肉厚,木心细,质硬,紧实,粉性足,香气浓。亳丹皮机器开口者,纵形隙口紧闭,平整,栓皮较完整,韧皮部较凤丹皮略薄;其中粗壮者,内表面与木质部连接处常有木纤维留下的细纵纹,细小者,粉性足,皮皱。川丹皮相对质脆,易碎,香气浓,亮银星(丹皮酚结晶)多而明显,栓皮常部分脱落。然而,这些差异背后的物质基础差异尚不十分清楚,牡丹皮道地性形成机制仍不明确。因此如何鉴定和评价不同道地产区牡丹皮是目前研究的重点和难点。

 

  此前,胡云飞等[118]已对铜陵及山东、山西、亳州、垫江等地产丹皮中差异成分作过分析,依据产地将铜陵产地归为道地药材组,其他产地归为非道地药材组,运用OPL-SD分析,认为丹皮酚原苷或其异构体、氧化芍药苷、四没食子酰葡萄糖、suffruticoside B/D可能是铜陵与其他产地丹皮的主要差异成分。但在其PCA聚类图中山东产丹皮与其他产地丹皮显示出最明显的差异,而铜陵与山西及重庆产丹皮差异不甚明显;且其对于牡丹皮中含量较高,传统作为优质评价指标的丹皮酚(牡丹皮药材中析出的丹皮酚结晶)和药理活性明确的丹皮多糖的含量均未做相应分析。因此,有必要对不同道地产区丹皮进行更加深入的研究。目前市场上所见牡丹皮以亳州产居多,普遍认为以铜陵产为最好。垫江作为传统道地产区,近年来,由于受到观赏牡丹高经济价值的冲击,产量较低,而其他产地丹皮在市场上极少见。因此,本研究以传统道地产区(铜陵及垫江)和新兴道地产区(亳州)产牡丹皮为研究对象。运用超高效液相色谱-四极杆飞行时间串联质谱联用技术(UPLC-Q-TOF-MS),对丹皮中芍药苷、丹皮酚苷、鞣质质谱裂解规律进行了探索和总结;结合代谢组学分析方法,对来自亳州、铜陵及垫江的牡丹皮进行差异成分研究,并对差异成分进行结构鉴定;运用中国药典丹皮酚和多糖含量测定方法,对不同产地丹皮样品中丹皮酚和多糖的含量进行测定。结果:运用OPL-SD分析共筛选出11种潜在差异成分,主要为丹皮酚及其苷类、芍药苷类、没食子酸衍生物。从没食子酸衍生物来看,安徽产牡丹皮含有较多的六没食子酰葡萄糖苷和七没食子酰葡萄糖苷,而垫江产牡丹皮中含有较多的Methyl gallate和Galloyl-3-O-methyl gallate。从丹皮酚及其苷类成分来看,安徽产牡丹皮中丹皮酚的含量较高,垫江产牡丹皮中丹皮酚新苷、丹皮酚原苷、Paeonol-O-β-D-glucoside和Suffruticoside A等丹皮酚苷类成分较多。另外,垫江丹皮中还含有较多的多糖。本章旨在分析比较不同道地产区牡丹皮中化学成分差异,为牡丹皮道地性形成机制研究奠定基础,为牡丹皮品质评价及商品规格等级标准的建立提供参考依据。

 

  5.1实验试剂、仪器及材料

 

  实验试剂及仪器:同第三章。

 

  牡丹皮样品:2017年8月至9月本文作者于垫江、亳州及铜陵采集四年生牡丹样品各十株,趁鲜去除木心,于30度烘干(48h),备用。

 

  5.2实验方法

 

  UPLC-QTOF-MS方法同第三章。多糖及丹皮酚含量测定方法参照中国药典牡丹皮项下丹皮酚的含量测定方法[2]。

 

  5.3.数据处理

 

  5.3.1不同产地牡丹皮样品差异成分分析

 

  对不同牡丹皮样品进行Q-TOF-MS分析,将LC-MS所得的数据导入到QI中,采用主成分分析(PCA)将不同产地药材分别聚成不同组别,由图5-2A可以看出,垫江与安徽(亳州和铜陵)产丹皮都可以明显区分,说明不同产地牡丹皮在化学成分上确有差异;采用有监督的正交偏最小二乘法辨别分析(OPL-SDA),选取Loadings绝对值大于0.10的作为差异峰,共得到14个潜在差异峰。其中,有些峰为同一个化合物的不同碎片,这些峰共代表了11个潜在的差异化合物。垫江与安徽产丹皮差异成分及相对峰面积强度见图5-2D,其相关化合物名称见表5-1。

 

  5.3.2不同产地牡丹皮丹皮酚含量测定结果

 

  不同产地牡丹皮中丹皮酚含量测定结果如图5-3所示,从图中可以看出不同产地牡丹皮中丹皮酚含量高低顺序为亳州略高于铜陵,铜陵略高于垫江,但各组间没有显著性差异。

 

  5.3.3不同产地牡丹皮多糖含量测定结果

 

  不同产地牡丹皮中多糖含量测定结果如图5-4所示,从图中可以看出不同产地牡丹皮中多糖含量高低顺序为垫江丹皮高于铜陵及亳州牡丹皮,铜陵牡丹皮中多糖含量略高于亳州,但两者无明显差异。

 

  5.4本章小结

 

  本研究首次运用UPLC-Q-TOF-MS对不同道地产区丹皮样品中化学成分进行了详细系统的分析。垫江丹皮和安徽丹皮中主要差异性成分为没食子酸衍生物、丹皮酚及其苷类、芍药苷类,其中六没食子酰葡萄糖苷和七没食子酰葡萄糖苷及丹皮酚在安徽产丹皮中相对含量较高,而多糖、丹皮酚苷(丹皮酚新苷、丹皮酚原苷、Paeonol-O-β-D-glucoside和Suffruticoside A)、芍药苷类(芍药苷、苯甲酰芍药苷、Isomer of galloylpaeoniflorin)和Methyl gallate、Galloyl-3-O-methyl gallate在垫江丹皮中相对含量较高。

 

  从没食子酸衍生物来看,安徽产牡丹皮含有较多的六没食子酰葡萄糖苷和七没食子酰葡萄糖苷,而垫江产牡丹皮中含有较多的Methyl gallate、Galloyl-3-O-methyl gallate,而Methyl gallate、Galloyl-3-O-methyl gallate可缩合成没食子酸鞣质。没食子酸鞣质类成分含有多数酚羟基,不稳定,易氧化,而不同产地牡丹皮外表颜色有所差异,可能与没食子酸鞣质类成分组成类别及含量的不同有一定的关系,同时,此类成分多具有强的抗氧化性,可能与丹皮和其所在的生态环境相适应有一定的内在联系。

 

  从丹皮酚及其苷类成分来看,安徽产牡丹皮中丹皮酚的含量较高,垫江产牡丹皮中丹皮酚新苷、丹皮酚原苷、Paeonol-O-β-D-glucoside和Suffruticoside A等可水解为丹皮酚的苷类成分较多。而垫江产牡丹皮药材中亮银星多而明显,但丹皮酚在鲜样中含量不如亳丹皮和凤丹皮多,可能与其中丹皮酚苷类成分在牡丹皮储存的过程中缓慢水解析出有关。此外,本研究还对市场上所购买的不同产地的牡丹皮药材中丹皮酚、丹皮酚新苷、丹皮酚原苷的含量进行了测定,结果表明:铜陵产牡丹皮中丹皮酚含量最高,垫江次之,亳州产牡丹皮中丹皮酚含量最低,具有显著性差异,而垫江产牡丹皮药材中丹皮酚新苷及原苷的含量均较低。说明加工方法,存贮时间及条件的不同,牡丹皮中丹皮酚苷类转化为丹皮酚的效率不同。

 

  目前,丹皮酚及其苷类、芍药苷类、没食子酸衍生物成分对中药原植物与环境之间关系的影响尚不明确,有待深入的研究。因此,下一步工作重点应转为研究差异性成分与植物生理和环境之间关系的研究上来,以揭示牡丹皮道地性形成机制。

 

  本研究还运用2015版《中国药典》硫酸-蒽酮法对牡丹皮中多糖含量进行测定,发现牡丹皮中多糖含量可高达8.85%,本易遭虫蛀,事实上牡丹皮正常干燥后,即使不熏硫,也不易霉变及虫蛀,这可能与丹皮酚相关。丹皮酚在牡丹皮中含量高,味微辣,具有芳香气味,具有抗菌[119]、抗病毒[120]作用;丹皮酚还可随水蒸气挥发,很可能散发到土壤中,抑制土壤中微生物的繁殖及生长。

 

  牡丹根不同部位化学成分差异分析

 

  牡丹皮为毛茛科植物牡丹Paeonia suffruticosa Andr的干燥根皮,具有清热凉血,活血化瘀的功效。秋季采挖根部,除去细根和泥沙,剥取根皮,晒干或刮去粗皮,除去木心,晒干。前者习称连丹皮,后者习称刮丹皮[2]。现代研究表明其具有丹皮酚及其苷类、芍药苷类、鞣质类、多糖等多种化学成分[78,101,121-124]。牡丹初始以“牡丹”为正名载于《神农本草经》[7],此时所用为其根,未去木心。至南北朝陶弘景所著《本草经集注》:“色赤者为好,用之去心”开始出现去心加工。[5]此后,牡丹皮去除木心的加工方法沿用至今。至金.张元素《潔古珍珠囊》[4]以后,因牡丹药用时均去木心,故以“牡丹皮”为正名载入此后的文献中。历版药典规定牡丹皮作为药材要抽去木心,而在实际生产中不可能将木心全部除去,抽心难易程度与直径有一定的关系,直径大的抽心较为容易,抽心率相对较高,售价也较高。另外,关于牡丹皮刮皮问题,清代以前的文献中均未提及牡丹加工需要去皮,近代才有连丹皮,刮丹皮的说法。而且据牡丹皮加工商介绍,各产地牡丹皮刮去栓皮主要是为了追求外观漂亮,达到与凤丹皮外观相似的目的。目前市场上除有刮丹皮,连丹皮外,还有大量抽心率很低的牡丹皮药材及牡丹皮片。因此,弄清牡丹皮栓皮、韧皮、木心不同部位中化学成分的差异具有重要意义。

 

  目前对于牡丹根不同部位化学成分的研究主要集中在运用HPLC或UPLC法测定以丹皮酚及芍药苷为主的某几种化学成分的含量上[125-127],普遍认为丹皮酚和芍药苷在栓皮中较多。这些方法从一定角度反映了牡丹根不同部位某些化学成分的差异,而少数或单一的化学成分并不能完全反映中药材质量,因此本研究采用超高效液相色谱-飞行时间质谱(UPLC-Q-TOF-MS)法首次对牡丹皮不同部位的化学成分进行快速识别,并结合正交偏最小二乘法OPL-SDA判别模式实现牡丹皮不同部位差异性标志物的区分,对牡丹根不同部位的化学成分展开系统研究,阐明牡丹皮刮皮、去心的科学合理性,为牡丹皮质量控制及资源利用提供参考依据。同时由于传统质量评价常将牡丹皮中的亮银星(牡丹皮中析出的丹皮酚结晶)作为中药的评价指标,而丹皮酚在本次建立的UPLC-QTOF-MS方法中响应很低,为实现传统与现代质量评价对接,本研究同时运用UPLC-QTRAP-MS-MS测定了牡丹皮中10种含量较高的化学成分的含量(包括丹皮酚)并分析其在不同部位的含量差异。

 

  6.1实验仪器、试剂及材料

 

  实验仪器及试剂:同第三章。

 

  牡丹皮样品:2017年9月本文作者从亳州采得牡丹样品共十株,趁鲜分离栓皮、韧皮和木心,(保证栓皮与韧皮之间,韧皮与木心之间的过渡区完全去除)于30度烘干(48h),备用。

 

  6.2实验方法

 

  同第三章。

 

  6.3.实验结果

 

  6.3.1 UPLC-Q-TOF-MS数据分析

 

  6.3.1.1 PCA,OPLS-DA多元统计分析

 

  对牡丹根不同部位进行Q-TOF-MS分析,总离子流色谱图见图6-1.从其总离子流图中可以看出牡丹根栓皮中含有的化学成分的种类和数量最多,木心最少。将所获得的质谱数据导入到QI软件中,因负离子模式下,可获得丰富的离子碎片,因此采用负离子模式进行PCA模式识别,见图6-2a.不同部位的牡丹根样品点完全分离,同一部位可以很好聚在同一区域。

 

  3.1.2牡丹根不同部位化学成分的OPLS-DA分析

 

  在PCA分析基础上,借助OPLS-DA对数据进行两维数据分析[118],从而得到牡丹皮数据散点图,见图6-2b,2c,2d。散点图中每个点代表RT-EM数据,横轴(X轴)表示可变量,数据点离原点越远,该点对样品分组差异的贡献值也就越大[118]。因而选取S型曲线两端,选取/loadings/≦0.1的点,作为可信度高的特征离子,其相对含量见图6-3。同时将QI中质谱数据导出到excel表格中,并将OPLS-DA筛选出的特征离子挑出,比较不同部位特征离子的相对含量差异。

 

  3.1.3差异成分鉴别

 

  对3.1.2筛选出的具有显著性差异的变量,进行质谱解析。为了使化合物鉴定结果更加可靠,首先对牡丹皮中所含化学成分的某些对照品的裂解规律进行探索,根据裂解碎片及相关资料推测各类化合物可能的裂解途径。再根据芍药属所含化合物及文献中所报道牡丹皮二级质谱碎片及标准品裂解规律,结合PDA特征光谱与化合物ClogP值等信息,以及芍药属已报道的相关研究进行成分鉴定,牡丹根各部位峰面积强度见图6-3。

 

  6.3.2 UPLC-QTRAP-MS-MS定量测定结果

 

  根据样品中各化合物的含量选择合适的标准曲线,并计算样品中各成分的含量。含量测定结果见图6-4。结果表明:总体来看,牡丹根栓皮中所含有的化学成分的含量最高;牡丹根丹皮酚含量以栓皮及韧皮中较多,木心中最少;丹皮酚原苷的含量以韧皮及木心中最多,栓皮中最少;丹皮酚新苷的含量以韧皮中最多,栓皮及木心中较少;芍药苷类成分均以栓皮中含量为最高;各部位没食子酸的含量差异不明显,没食子酸甲酯含量以木心为最,韧皮次之,栓皮中最少;五没食子酸葡萄糖苷的含量以木心为最多,韧皮及栓皮中含量较少。

 

  6.4本章小结

 

  从化合物种类的角度来看,牡丹根栓皮中含有的化合物种类最为丰富,多种成分在栓皮中的含量远高于韧皮及木心,有些成分仅在栓皮中检出。而清以前的本草文献中均未提及牡丹皮加工需要去除栓皮,另外,考虑到加工成本及牡丹皮传统加工方法,建议牡丹皮在加工的过程中可以不用去皮;木心中所含化学成分的种类最少,且多种化学成分的含量较低,验证了牡丹皮在加工的过程中需去除木心的科学合理性。

 

  究其原因可能是,木心在牡丹中主要起支撑的作用,主要含有质韧的木纤维,而含有的次生代谢产物的种类较少;韧皮部为牡丹的营养器官,粉性足,含有较多的糖类,因牡丹为多年生灌木,冬季地上部位枯萎,仅地下部分存活,来年又在原来的根茎上抽出茎秆,有些甚至在其根部发出小芽,这些均需要大量的能量供给,因此牡丹根韧皮中糖类积累,有助于其完成正常的生长发育过程。同时韧皮部在牡丹根中所占的比例较大,也储存了大量的次生代谢产物;而栓皮对牡丹根具有保护作用,因此其含有的次生代谢产物的种类最为丰富。

 

  从化学成分的含量的角度来看,牡丹皮栓皮中芍药苷类和鞣质类成分的种类和数量均较多;韧皮中寡糖和丹皮酚苷类成分较多。牡丹根栓皮中鞣质类成分的种类及数量均较多。鞣质类成分含有多数酚羟基,具有较强的抗氧化性,其在牡丹根木心和栓皮中含量高,可保护植物。此外,鞣质类成分通常有颜色,氧化或聚合后颜色加深,而牡丹皮栓皮颜色较韧皮及木心均较深,可能与此相关;牡丹皮中芍药苷类成分是一种单萜类糖苷化合物,为芍药科植物专属性化合物,亦是牡丹皮中的主要次生代谢产物,具有抗自由基损伤,抑制细胞内钙超载和抗神经毒性等活性,其中芍药苷、氧化芍药苷、苯甲酰芍药苷、苯甲酰氧化芍药苷在牡丹皮栓皮中含量均较高。

 

  丹皮酚原苷、丹皮酚新苷及丹皮酚在韧皮中含量均较高;丹皮酚原苷在木心中含量较高,而丹皮酚新苷和丹皮酚在木心中含量均较低;丹皮酚新苷和丹皮酚原苷在栓皮中均较低,而丹皮酚在栓皮中含量较高。可能的原因是丹皮酚原苷和丹皮酚新苷相对稳定,其在韧皮部中产生、聚集并转化为丹皮酚,转运到栓皮,通过栓皮发挥保护作用。

 

  本研究也解释了张雨凤等[128]的结论,即:在不同等级牡丹皮中,四等牡丹皮中芍药苷含量最高,一等牡丹皮中丹皮酚含量最高;芍药苷含量在主根中最少,在支根中最多;市场上连丹比刮丹中芍药苷含量高,刮丹比连丹中丹皮酚含量高。因牡丹皮药材越细,栓皮所占的比例越大,芍药苷的含量越高,丹皮酚的含量越低。

 

  不同等级牡丹皮化学成分与性状相关性研究

 

  新中国成立以来,我国共颁布实施了3次中药材商品规格等级标准,现行的是1984年由原国家医药管理局和卫生部联合颁布的《76种药材商品规格标准》[129],在牡丹皮项下主要按照产地和加工方法将牡丹皮划分为凤丹皮、原丹皮和刮丹皮,各规格项下又根据中部围粗和药材长度将牡丹皮细分为4个不同的等级。现今,市场发生了翻天覆地的变化,就目前市场调查来看,牡丹皮规格划分相对统一,等级划分比较混乱。牡丹皮药材规格按照产地主要分为凤丹皮,川丹皮,亳丹皮。凤丹皮在产地又按照不同的药用部位分为大头壳、主根、节子。主根又按大小分为一等、二等、三等;节子按大小分为大节子和节子。亳丹皮和川丹皮在产地按照加工方法,又分为刮丹皮(牡丹皮刮去粗皮者)和原丹皮(又称为连丹皮,为牡丹皮未刮去粗皮者);依据求购商的需求,又按照长短、粗细分为不同的等级。虽均有一等、二等。。。之分,但是,各产地、药材市场划分情况不一致,各个体经营户之间划分也不统一,对于相同的牡丹皮药材,不同商户可能将其归为不同的等级。因此,为规范中药材市场,指导牡丹皮药材在市场上的流通交易,制订新的牡丹皮药材商品规格等级标准迫在眉睫。

 

  近些年不少学者对不同商品规格等级的牡丹皮展开了相关化学评价研究[128,130-132],都测定了不同规格等级牡丹皮药材或饮片中以丹皮酚为主的次生代谢产物的含量,并将同一规格等级的药材归为一组,进行化学成分含量高低比较分析,均未对其含量与药材的性状之间的相关性进行深入的相关性分析。而市场上牡丹皮等级是依据其直径和长度进行划分,但其等级划分混乱,没有统一的标准,对于相同的药材,不同商户可能将其归为不同的等级。因此本研究除测定不同等级牡丹皮中次生代谢产物及多糖的含量,对其长度、直径、皮部厚度及个体质量等性状指标亦进行测定,并分析其与化学成分之间有无相关性。以期为牡丹皮药材商品规格等级的划分提供依据。

 

  7.1实验试剂、仪器和材料

 

  实验试剂和仪器见第三章。

 

  实验材料:牡丹皮样品:样品1-28为2016年5月至2017年10月由本文作者从亳州、铜陵、垫江各牡丹皮产地及河北安国药材市场、亳州药材市场、成都荷花池药材市场采得。

 

  7.2实验方法

 

  7.2.1 UPLC-QTOF-MS方法

 

  同第三章UPLC-QTOF-MS方法。

 

  7.2.2性状数据测定

 

  对铜陵产不同等级及市场上购得的不同粗细的牡丹皮的牡丹皮药材进行性状测定,每份样品随机取10个个体,测定其长度、外径、内径、及个体质量进行测定,计算均值。

 

  7.2.3多糖含量测定方法

 

  同第三章。

 

  7.3实验结果

 

  7.3.1次生代谢产物含量

 

  次生代谢产物含量测定结果见表7-1。所有样品中没食子酸的含量在0.050%~0.274%之间,其均值为0.112%;丹皮酚原苷的含量范围为0.011~1.677%之间,均值为0.521%;没食子酸甲酯的含量在0.023%~0.343%之间,均值为0.189%;氧化芍药苷的含量范围为0.246%~0.728%,均值为0.444%;丹皮酚的含量在2.971%~7.298%,均值为5.010%;五没食子酸葡萄糖苷的含量范围为0.064%~0.158%,均值为0.098%;苯甲酰氧化芍药苷的含量范围为0.043%~0.157%,均值为0.083%;丹皮酚新苷的含量在0.012~3.526%之间,均值为1.207%;芍药苷的含量范围为0.858%~2.591%,均值为1.644%;苯甲酰芍药苷的含量在0.108%~0.764%之间,均值为0.328%。

 

  7.3.2性状数据测定结果

 

  不同等级的牡丹皮药材的长度范围为6.9~20.3cm,均值为11.2cm;外径在0.37cm~1.38cm之间,均值为0.92cm;内径范围为0.11cm~0.8cm,均值为0.44cm;皮部厚度范围为0.16cm~0.36cm之间,均值为0.28cm;个体质量范围为1.2g~17.5g之间,均值为5.8g。《中国药典》规定连丹皮药材长5~20cm,直径0.5~1.2cm,厚0.1~0.4cm。基本符合药典外观性状要求。

 

  7.3.3多糖含量

 

  多糖含量测定结果见表7-2。不同等级牡丹皮多糖含量在5.01%~8.85%之间,均值为6.78%。不同等级见牡丹皮中多糖的含量确有差异,且随着牡丹皮药材由大到小,其多糖含量呈下降的趋势,此与牡丹皮产地无关。牡丹皮中多糖的含量还与其熏硫程度有一定的关系,高硫样品中多糖含量较高。

 

  以各次生代谢产物含量、性状数据做Pearson直线相关分析(SPSS),结果如表7-3所示,各性状数据之间均呈正相关性,说明本实验设计选定的性状数据及其测量结果比较科学;芍药苷类成分之间均呈显著正相关性;除1,2,3,4,6-五没食子酰葡萄糖苷以外,其他次生代谢产物含量均与其外观性状大小呈负相关性,且多数呈显著的负相关关系。

 

  7.4本章小结

 

  牡丹皮中次生代谢产物的含量多与其外观大小成负相关性,而多糖含量与外观性状的大小成正相关性。此外,本研究还对不同抽心率的牡丹皮药材中化学成分和多糖含量进行了测定,结果表明:随着抽心率的提高,牡丹皮药材中多糖含量略有升高的趋势,而其他次生代谢产物的含略有下降的趋势。究其原因可能是:1.牡丹皮中次生代谢产物在栓皮中分布较多,直径越大,栓皮所占比例越小,含量越低;而多糖多分布于韧皮部,直径越大,其含量越高;2.牡丹皮中可被检测的多为可溶性多糖,其含量在牡丹皮中较高,加上其他不可溶性多糖,其在牡丹皮中所占的比例很大,因此多糖含量越高,其次生代谢产物的含量会相对降低。这可能与次生代谢产物在栓皮中含量较多,而在韧皮部中较少有关,直径越大,韧皮部所占的比例越大,次生代谢产物的含量越低。因此,不能仅根据牡丹皮药材中化学成分的含量来判断其品质好坏。

 

  传统对中药品质的评价多是基于外观形状、口感、色泽等感官经验,是在长期临床应用基础上对中药有效性和安全性的经验总结,具备一定的科学性,至今仍在药材贸易和临床应用中发挥作用;但经验判别往往较粗略,准确性、可定量性较差,且可能随鉴定人的知识、经验不同,而影响结果的重现性[133]。以化学成分为主的研究,是中药其他研究的基础,但以某些单一的化学指标来划分中药商品规格等级缺乏合理性,因中药化学成分复杂,在使用时是多种化学成分共同起作用的,大量研究表明[134-145]:黄连、苍术、当归、川芎、黄芪等药材的等级与指标性成分的含量没有明显关系,等级较高的药材有时质量反而较差;以生物活性为指标的研究做的还不够深入,中药具有多靶点作用的特点,某一生物活性指标不能代表该药的生物活性,且难以量化生物活性指标;以传统的经验+现代技术相结合的方法看似科学合理,但难以实现在药材交易市场的快速,实时评价。而中药材商品规格标准是一个应用性标准,应切合市场实际,因此本次标准制订坚持“基于药典、市场第一、简便实用”的原则。不以中药的化学成分含量或生物活性高低定等级好坏,而是根据目前市场上的不同商品规格等级的中药材,规定各规格等级下中药材(特别是外观性状)应具有的特点,中药材求购商可根据需求选择合适的规格等级,发挥不同规格等级中药材的最大作用,从而指导中药材在市场上的交易。

 

  结论与展望

 

  本研究首次采用UPLC-OTOF-MS法对牡丹皮中化学成分裂解规律进行系统总结,并对其含有的化学成分进行了系统解析,共解析出122个化合物。并在此基础上主要运用OPL-SD分析方法对不同产地、不同加工方法(熏硫、脱硫与烘干)、牡丹根不同部位的化学成分差异进行了分析。同时,运用UPLC-QTRAP-MS-MS法分析了不同规格等级、不同产地、不同加工方法(熏硫、晒干)、不同部位主要化学成分含量差异。运用Pearson直线相关分析对不同等级牡丹皮化学成分含量与外观性状的相关性进行了分析,阐明牡丹皮化学成分与外观性状之间的相关性;对不同等级牡丹皮性状进行测定分析,并制订了牡丹皮商品规格等级标准草案。

 

  熏硫加工过程中牡丹皮中会产生复杂的化学反应,导致牡丹皮中次生代谢产物含量的变化,有些成分含量升高,有些成分含量降低。而脱硫在降低SO2残留量的同时,也会导致牡丹皮中许多化学成分含量进一步降低,这些化学成分含量的变化必然导致临床疗效的改变,因此,在尚未弄清其中化学成分的转化关系及化学成分的转化量与熏硫程度之间关系,新产生的化合物的药理和毒理作用不明确,且无法控制硫熏程度的情况下应尽量避免在产地加工中对其进行熏硫;而脱硫会使牡丹皮中多种化学成分的含量降低,会使牡丹皮药材质量进一步降低,应禁止使用。

 

  牡丹根栓皮中含有的化合物种类最为丰富,多种成分在栓皮中的含量远高于韧皮及木心,有些成分仅在栓皮中检出。而清以前的本草文献中均未提及牡丹皮加工需要去除栓皮,另外,考虑到加工成本及牡丹皮传统加工方法,建议牡丹皮在加工的过程中不用去皮;而木心中所含化学成分的种类最少,且多种化学成分的含量较低,验证了牡丹皮在加工过程中需去除木心的科学合理性。

 

  垫江丹皮和安徽丹皮中主要差异性成分为没食子酸衍生物、丹皮酚及其苷类、芍药苷类,其中六没食子酰葡萄糖苷和七没食子酰葡萄糖苷及丹皮酚在安徽产丹皮中相对含量较高,而多糖、丹皮酚苷、芍药苷类和Methyl gallate、Galloyl-3-O-methyl gallate在垫江丹皮中相对含量较高。值得注意的是从丹皮酚及其苷类成分来看,安徽产牡丹皮中丹皮酚的含量较高,垫江产牡丹皮中丹皮酚新苷、丹皮酚原苷、Paeonol-O-β-D-glucoside和Suffruticoside A等可水解为丹皮酚的苷类成分较多。说明加工方法,存贮时间及条件的不同,牡丹皮中丹皮酚苷类转化为丹皮酚的效率不同。

 

  牡丹皮中次生代谢产物的含量多与其外观大小成负相关性,而多糖含量与外观性状的大小成正相关性。此外,本研究还对不同抽心率的牡丹皮药材中化学成分和多糖含量进行了测定,结果表明:随着抽心率的提高,牡丹皮药材中多糖含量略有升高的趋势,而其他次生代谢产物的含略有下降的趋势。这可能与次生代谢产物在栓皮中含量较多,而在韧皮部中较少有关,直径越大,韧皮部所占的比例越大,次生代谢产物的含量越低。因此,不能仅根据牡丹皮药材中化学成分的含量来判断牡丹皮质量好坏。

 

  而传统对中药品质的评价多是基于外观形状、口感、色泽等感官经验,是在长期临床应用基础上对中药有效性和安全性的经验总结,至今仍在药材贸易和临床应用中发挥作用。中药材商品规格标准是一个应用性标准,应切合市场实际,因此本次标准制订坚持“基于药典、市场第一、简便实用”的原则。不以中药的化学成分含量或生物活性高低定等级好坏,而是根据目前市场上的不同商品规格等级的中药材,规定各规格等级下中药材(特别是外观性状)应具有的特点,中药材求购商可根据需求选择合适的规格等级,发挥不同规格等级牡丹皮药材的最大作用,从而指导其在市场上的交易。

 

  不同产地、不同等级牡丹皮在化学成分含量上确实存在差异,此差异与产地加工(熏硫、脱硫、抽心)、储藏(发霉)以及不同部位带来的差异相比可谓微乎其微,因此,在牡丹皮质量控制上应将工作重点转至牡丹皮加工、储藏过程中的控制。而找到一个新的经济高效的既能快速干燥又能防霉防蛀的中药材储存方法是目前中药材质量控制的重点工作。

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