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药理学论文 microRNA-198对食管癌细胞生物学特性的影响

2019-03-11 10:47:43来源:组稿人论文网作者:婷婷

  摘要

 

  背景

 

  食管癌是世界范围内的一种常见的恶性肿瘤,其发病率居恶性肿瘤的第8位,死亡率居癌症死因的第6位。目前治疗手段以外科手术、放化疗为主,治疗效果迄今仍未臻满意。我们前期在相同TNM病理分期而预后不同的食管癌组织样本中运用高通量miRNA芯片杂交技术发现,microRNA-198(miR-198)在预后较差组织中表达明显升高。本论文拟在分子水平研究miR-198对食管癌细胞的作用,研究结果有助于进一步阐明miR-198在食管癌发生和发展中扮演的角色,并将为miR-198及其靶基因用于食管癌的分子分型、预后判断、靶基因治疗及临床治疗方案的选择等临床转化研究奠定理论和实验基础。

 

  目的

 

  研究miR-198异常表达对食管癌细胞EC9706增殖、凋亡、迁移等生物学特性及其靶基因表达的影响。

 

  方法

 

  实时荧光定量PCR(qPCR)法检测miR-198在不同食管癌细胞株中的表达情况。采用miR-198模拟物(mimics)、miR-198抑制物(inhibitor)靶向改变miR-198在食管癌细胞株EC9706的表达;利用噻唑蓝(MTT)法、平板克隆形成实验、流式细胞术、Transwell小室实验、划痕实验等方法观察miR-198异常表达对食管癌EC9706细胞增殖、凋亡及迁移等生物学特性的影响。利用TargetScan、miRTarBase、Diana、Pictar四个miRNA靶基因预测数据库预测miRNA-198可能的靶基因,并运用qPCR的方法检测食管癌细胞中过表达miRNA-198对潜在靶基因PTEN(phosphatase and tensin homology deleted on chromosome ten)的影响。

 

  结果

 

  (1)qPCR检测结果表明:miR-198在食管癌细胞株EC9706的表达明显高于在Eca109中的表达(P<0.01);

 

  (2)食管癌细胞株EC9706转染mimics或inhibitor后miRNA-198的表达明显上调或下调(P<0.05);

 

  (3)MTT检测和平板克隆形成实验结果表明:miR-198表达上调或下调对食管癌细胞EC9706增殖无明显影响(P>0.05);

 

  (4)流式细胞仪检测细胞凋亡率和qPCR检测凋亡相关基因Bcl2、Bax表达结果显示:miR-198异常表达对食管癌细胞EC9706凋亡无显著影响(P>0.05);

 

  (5)细胞Transwell实验和划痕实验结果:与阴性对照组比较,miR-198 mimics组迁移至下室的细胞数明显增多;miR-198 inhibitor组实验结果则相反(P<0.05)。miR-198 mimics组在12 h、24 h、48 h细胞迁移距离大于阴性对照组;inhibitor组在12 h、24 h、48 h细胞迁移距离小于阴性对照组,差异有统计学意义(P<0.01);

 

  (6)qPCR检测结果显示,候选靶基因PTEN在miR-198过表达的食管癌细胞EC9706中相对表达量显著降低(P<0.01)。

 

  结论

 

  miR-198在食管癌细胞EC9706细胞株中高表达。上调miR-198的表达能够促进食管癌细胞EC9706的迁移但对细胞的增殖和凋亡无明显影响。miR-198表达上调可降低候选靶基因PTEN在食管癌细胞EC9706中的表达。

 

  关键词食管癌;microRNA;miR-198;细胞生物学特性

 

  前言

 

  食管癌(Esophageal carcinoma,EC)是最常见消化道恶性肿瘤之一,占消化系统各部位肿瘤死亡的第二位。食管癌发病率居恶性肿瘤的第8位,死亡率居癌症死因的第6位我国是食管癌发病率和死亡率最高的国家之一,占全球食管癌发病的50%以上,每年平均死亡约15万人。在我国高发恶性肿瘤中食管癌居恶性肿瘤的第4位,死亡率为17.38/10万,仅次于胃癌、肺癌和肝癌。根据病理类型,食管癌主要分为鳞状细胞癌和腺癌,前者发病率在我国占90%以上。在本论文研究中如未作特殊说明,作为我们研究目标的食管鳞状细胞癌简写为食管癌。由于食管癌起病隐匿,早期症状不典型,癌症病变解剖部位较特殊,临床上缺乏有效的早期诊断方法等因素,加之食管癌具有较强的侵袭转移能力,在早期就可以转移至周围淋巴结核邻近的组织器官,导致70~80%的食管癌患者确诊时已属于晚期。目前,临床上对食管癌的治疗手段以外科手术、联合药物化疗、术前辅助放化疗、同期放化疗相结合的方式为主,但总体疗效迄今仍未臻满意。其5年生存率只有15%左右,75%的患者于确诊1年内死亡。食管癌病因及发生发展的分子机制尚不清楚,缺乏食管癌早期诊断的敏感、特异性分子指标,是导致食管癌死亡率高、预后差的主要原因之一。因此,寻找针对食管癌,特别是对早期食管癌特异性及敏感性都比较理想的肿瘤标志物,对于提高早期诊断率、改善患者预后和降低食管癌的死亡率是至关重要的。

 

  尽管食管癌的诊断和治疗有了较大进展,但由于食管癌具有高度的侵袭性,治疗效果不理想,尤其是食管癌患者术后早期淋巴结转移是导致治疗失败和死亡的主要原因。因此,深入探索肿瘤转移的规律和机理将有助于食管癌的有效治疗和预后判断。目前,在食管癌的临床诊疗过程中,判断其分期分型及预后的主要方法还是传统的Tumor Node Metastasis(TNM)肿瘤分期法,即通常术后诊断为早期的,转移较晚;术后诊断为晚期的,转移较早。但本课题组成员在长期的食管癌外科临床治疗中发现:病理分型相同、分化程度相同、肿瘤分期相同、术者相同、术式相同的食管癌患者存在截然不同的预后结果,术后出现肿瘤转移时间相差悬殊,早的术后一至六个月发生转移,晚的术后三年或更晚发生转移。另外还发现,某些早期食管癌患者在术后早期阶段就发生淋巴结转移,从而导致其预后不良。这种临床现象对患者及外科医师的信心均是沉重打击,部分患者甚至对外科手术疗效产生疑问。这些临床观察结果表明,食管癌术后肿瘤转移是术后病人死亡的主要原因,不同食管癌患者体内存在有肉眼和常规病理检查不能观察到或没有涉及到的与肿瘤转移有关的信号分子及传导通路的个体差异性变化,从而导致传统的TNM肿瘤分期无法解释的上述现象。根据上述现象我们推测,食管癌转移发生的早晚取决于不同个体内基因/信号分子的差异性。因此,利用分子生物学技术,发现并深入研究这些与食管癌转移相关的分子指标对于在TNM肿瘤分期的基础上进行进一步的与肿瘤转移有关的分子分型具有重要意义。这不仅有助于预后的预测,还有助于治疗方案的选择,并将有助于针对阻止癌细胞转移的特异性靶向基因治疗的实现,从而达到降低其死亡率的最终目的,必将为食管癌的临床工作带来直接的指导意义。

 

  近年来兴起的microRNA(miRNA)研究为探索食管癌的侵袭转移机制、寻找新的诊断标记物和治疗靶点提供了很有前景的研究方向。深入研究miRNAs在食管癌发生发展、侵袭转移中的相关机制,对寻找针对食管癌新的诊断标记物和治疗靶点,实现食管癌的分子分型、治疗策略选择及预后判断具有重大的理论和现实意义。miRNA是一类进化保守的单链非编码调控小RNA,由17~25个核苷酸组成,通过序列特异性翻译抑制调控基因表达,进而参与细胞发育、增殖、分化、凋亡等一系列重要生物学进程。

 

  miRNA能够识别并结合到靶基因的3’UTR区的结合位点,通过诱导mRNA的降解降低靶基因的表达,在肿瘤中发挥着癌基因或者抑癌基因的功能,参与肿瘤的发生发展和侵袭转移等各个生命步骤。目前已有研究发现若干miRNA直接参与食管癌的发生和发展,miRNA表达谱与食管癌的诊断、分期、进展和预后等相关。例如,四种miRNAs(miR-25,-99a,-133a,133b)显示出很好的作为诊断标志物的潜力,五种miRNAs(miR-21,-27b,-126,-143,-145)有望用作诊断和预后判断的标志物。多种miRNAs包括miR-27a,-185,-203等在食管癌组织中的表达量显著低于或高于癌旁正常组织,并可通过其相应的靶基因及下游基因对食管癌细胞的增殖、凋亡、迁移及侵袭产生影响。这些研究表明,miRNA在人类食管癌发生发展中扮演着重要角色,有望成为新型食管癌生物学标记物,用于食管癌的诊断、预后评估和靶向治疗

 

  目前虽然国内外众多学者对许多与肿瘤转移的基因及蛋白进行了广泛基础研究,但选择的标本多为不同的病理分期,且集中于一般的、共性的肿瘤转移规律研究,而缺乏对相同病理分期又不合乎肿瘤转移一般规律的针对性研究。本课题组一直致力于食管癌的临床诊疗及发病机制基础研究,针对在长期的临床实践中发现的相同TNM病理分期、同一术者、相同术式却有着截然不同预后问题,难以用肿瘤生物学特性如肿瘤分化程度、生长方式、浸润深度等因素以及用临床因素如手术方式、营养状况、精神状况、术后治疗等理论加以理解和解释。因此,结合已发现的miRNA在食管癌中的作用研究,我们提出设想:相同食管癌TNM病理分期而术后预后不同样本之间存在miRNA的差异表达,这些特异的miRNA及其靶基因的异常表达可能导致术后预后的显著不同。

 

  为此,我们前期研究应用高通量miRNA芯片杂交技术,对两例食管癌患者的石蜡肿瘤样本中的754个miRNA进行了表达谱的研究。两例食管癌患者均为TNM IIa分期,一例术后四个月出现颈部淋巴结转移且一年内死亡,为预后不良;另一例术后无转移且存活5年以上,为预后良好,二者接受的术后治疗(化疗两次)相同。研究结果表明,多种miRNAs的水平在两例患者之间显著不同。与预后较好的患者比较,88个miRNAs或片段表达升高2倍或以上,下降至0.5以下者4个。其中miR-198在预后差患者的表达水平较在预后良好患者明显升高。随后对46例相同病理分期但预后不同的患者(其中18例患者为预后良好-术后无转移无复发无治疗且生存期超过5年,28例患者为预后不良-术后1年内无复发但出现肿瘤转移并死亡)进行了研究。结果与前期发现一致,即miR-198在预后不良的食管癌肿瘤组织中比在预后良好的肿瘤组织中表达水平明显升高5.905倍;miR-198高表达与肿瘤转移早、患者生存期短,具有相关性。miR-198高表达的患者生存时间较短。患者预后(P=0.014)、肿瘤大小(P=0.040)和miR-198表达(P=0.012)与生存时间之间有显著的关联性;其相关危险性分别为7.268,1.246,3.524。以上结果表明miR-198的过表达与食管癌的较差预后相关,有望作为一种生物标志物用于食管癌病例的手术筛选和预后判断。

 

  人miR-198基因,has-mir-198定位于染色13q13.3。miR-198表达水平的异常与多种疾病包括肿瘤的发生发展有关,已有研究表明miR-198在肺癌、胰腺癌、前列腺癌、肝癌等多种肿瘤的发生发展及转移中具有重要的作用。例如miR-198在肺癌细胞中可通过作用于靶基因FGFR1抑制细胞增殖和诱导凋亡;表达下调的miR-198的有望作为一种生物标记用于诊断肺腺癌恶性胸腔积液;miR-198可通过靶向作用于HGF/c-MET通路抑制肝癌细胞的迁移和侵袭。低表达的miR-198及其下游通路对肝癌和胰腺癌肿瘤细胞生物学功能有抑制作用。过表达的miR-198及其下游通路对视网膜恶性肿瘤和舌鳞状细胞癌肿瘤细胞生物学功能有促进作用。由此推断,miR-198与多种肿瘤发生发展相关,但是这种相关性具有组织特异性。也就是说,它们在不同组织类型肿瘤的发生、发展过程中的作用可能不同,表现为其水平高低变化的不同。因此,深入研究miR-198在具体肿瘤发生和发展中所特有的作用,具有临床指导意义。目前我们虽然发现miR-198与食管癌患者术后早期复发和预后密切相关,但特异性表达上调的miR-198与其靶基因调控机制在食管癌进程中的病理学意义如何?能否作为早期诊断治疗和预后判断的生物学基础?miR-198在食管癌预后转移中作用程度如何,能否用于防止癌细胞的转移?这些miR-198在食管癌发生发展中的具体作用仍不清楚,相关研究尚未见文献报道。

 

  目前,对于食管癌患者肿瘤分期相同但是由于术后转移与否而导致生存期具有明显差异性的机制尚不明确。因此,为阐明上述问题及基于前期研究结果,本课题拟进一步检测miR-198在不同食管癌细胞株中的表达;通过靶向改变食管癌细胞中miR-198的表达,探讨miR-198对食管癌细胞增殖、凋亡、迁移的影响及miR-198及其靶基因的作用及机制。可以预见,如能证实miR-198的异常表达可以作为与食管癌术后早期转移相关的一种生物标志物,不但有助于研制出相应的肿瘤进展监测、辅助诊断试剂盒,而且也有助于发现具有潜在治疗价值的新型小分子药物,由此可给予miR-198异常表达的食管癌患者相应的生物学干预,以达到抑制肿瘤转移延长生存期的目的。这将为进一步研究食管癌患者的分子分型、预后判断、靶基因治疗及临床治疗方案的选择等临床转化研究奠定理论和实验基础。

 

  qPCR法检测miR-198在人食管癌细胞中的表达

 

  材料

 

  1细胞株人类食管鳞癌细胞(EC9706)、食管腺癌细胞(Eca109)购自中国科学院细胞库。

 

  2主要试剂

 

  胎牛血清Gibco公司

 

  胰蛋白酶Gibco公司

 

  高糖DMEM Gibco公司

 

  青霉素/链霉素碧云天生物技术研究

 

  PBS北京中杉生物技术有限公司

 

  RNAzol®RT RNA Isolation Reagent广州复能(GeneCopoeia)基因有限公司

 

  All-in-OneTMmiRNA qPCR Detection Kit广州复能基因有限公司

 

  All-in-OneTMmiRNA First-Strand cDNA Synthesis Kit广州复能基因有限公司

 

  异丙醇上海宏瑞化工有限公司

 

  无水乙醇上海宏瑞化工有限公司DEPC广州晶欣生物科技有限公司EB武汉博士德生物工程有限公司琼脂糖Invitrogen公司

 

  50TAE(Tris-乙酸电泳缓冲液)北京索莱宝(Solarbio)科技有限公司

 

  3主要仪器

 

  高速低温台式离心机德国Eppendorf公司

 

  荧光定量PCR仪(PIKOREAL 96 Real-Time PCR System)美国Thermo公司

 

  电子天平上海精天电子

 

  微量加样器Eppendorf

 

  生物净化工作台苏州净化设备有限公司

 

  CO2细胞培养箱美国Thermo公司

 

  倒置显微镜日本尼康ECLIPSE Ti-S公司

 

  酶标仪以及检测系统Molecular Devices公司

 

  恒温加热磁力搅拌器巩义予华仪器有限公司4主要试剂配制

 

  PBS缓冲液配制(pH7.4):称取磷酸二氢钾0.20 g,磷酸氢二钠2.90 g,氯化钠8.0 g,氯化钾0.20 g,加入800 mL ddH2O中,混合均匀,使用实验室专用酸度计调pH至7.4,再加ddH2O至1000 mL,121C高压蒸汽灭菌30 min,4C保存备用。DEPC水:DEPC与双蒸水按1 mL:1000 mL比例配制,磁力搅拌器下振荡混匀4 h,37C下保存12 h以上,121C高压灭菌30 min,4C保存备用。胰酶配制:称取胰蛋白酶250 mg,置于研磨器中研磨成细粉,加少量D-Hanks液调制成糊状后再加适量D-Hanks液,使用碳酸氢钠调pH至8.0后,加入0.2%的EDTA-Na2,搅拌直至完全溶解,经0.22μm滤膜滤过除菌后分装,-20C保存备用。DMEM配制:首先制备新鲜的去离子水,称取DMEM干粉26.8 g,碳酸氢钠7.14 g,加终体积一半的去离子水,搅拌使全部溶解,定容至终体积,0.22µM滤器除菌后,分装于200 mL经灭菌处理过蓝盖瓶中,4C保存。完全培养基配制:取180 mL的DMEM培养基,加20 mL的胎牛血清,混匀后加2 mL青霉素/链霉素,4C保存备用,胎牛血清事先应在4C冰箱中慢慢融化。方法

 

  1细胞复苏

 

  实验前先将超净工作台在紫外灯下照射30 min,并将完全培养基DMEM置于37C恒温水浴箱内预热;

 

  从液氮罐中取出一支细胞冻存管后,迅速放到37C水浴箱中,并不断摇晃,使之在3 min内融化完全,目的是使冻存时细胞外的冰晶可以迅速融化,避免冰晶慢融进入细胞内形成再次结晶,对细胞造成损害;

 

  在超净工作台内用微量移液器分别将细胞悬液转移至10 mL的离心管中,加入5倍体积的不完全DMEM培养基;

 

  平衡离心,放入离心机中800 r/min离心510 min;

 

  弃去上清液,重复以上操作,彻底除去冻存液后向离心管中加DMEM完全培养基4 mL,轻轻地吹打成均匀的细胞悬液,转移至细胞培养瓶中,将培养瓶放入细胞培养箱内,37C、5%CO2培养24~48 h后换液继续培养,换液的时间由细胞生长情况而定。

 

  注意事项:

 

  从液氮中取细胞时应做好防护措施,以防冻伤;

 

  DMSO是一种渗透性保护剂,能够降低细胞冰点,减少冰晶的形成,减轻自由基对细胞损害,改变生物膜对电解质、药物、毒物和代谢产物的通透性。但DMSO对细胞并不是完全无毒副作用,在常温时对细胞毒副作用较大,因此,冻存管从液氮中拿出后应在3 min内完全融化,否者将造成细胞损伤;

 

  离心时转速不易过大,时间不易过长,以防细胞损伤。

 

  2细胞培养

 

  (1)传代前准备

 

  ①预热培养用液:把已经配制好并已灭菌的装有DMEM完全培养基、胰蛋白酶和PBS液的瓶子放入37C水浴锅内预热;

 

  ②紫外线照射超净工作台和细胞间30 min后通风;

 

  ③换上干净拖鞋和白大衣后方可进入细胞间,用75%酒精擦拭双手并带上口罩;

 

  ④传代前需正确摆放使用的器械,保证有足够的操作空间,这不但便于操作而且可以减少交叉污染;

 

  ⑤酒精灯的火焰不能太小,进行烧口灭菌时应使用外焰;

 

  ⑥准备好将要使用的消毒后的空培养瓶,放入超净工作台中;

 

  ⑦取出预热好的培养用液:自水浴锅中取出已经预热好的培养用液,用酒精棉球擦拭外表面后方能放入超净台内;

 

  ⑧从培养箱内取出EC9706、Eca109细胞:注意取出细胞时要把培养瓶的瓶盖旋紧,用酒精棉球擦拭显微镜的台面以及培养瓶和手套触及的位置,再在镜下观察细胞长势;

 

  ⑨在超净工作台中,将各瓶口打开的同时要在酒精灯外焰处烧口消毒。

 

  (2)胰蛋白酶消化

 

  ①加入消化液:小心倾倒出旧培养液,用PBS清洗2遍(冲洗),加入适量消化液(胰蛋白酶液)1 mL,注意消化液的量以盖住细胞最好,将细胞培养瓶放入培养箱中以保证最佳消化温度37C;

 

  ②显微镜下观察细胞:倒置显微镜下观察消化细胞,若胞质回缩,细胞之间不再连接成片,表明此时细胞消化适度;

 

  ③终止消化:弃去胰蛋白酶液,加入新鲜的完全培养基终止消化。

 

  (3)制备细胞悬液:

 

  ①用滴管将已经消化适度的细胞吹打成单细胞悬液;

 

  ②将细胞悬液吸入10 mL离心管中,平衡后将离心管放入台式离心机中,以800 r/min离心5分钟;

 

  弃去离心管中的培养基,加入3 mL的PBS,吹打悬浮细胞以彻底清洗,放入离心机中800 r/min离心3分钟;

 

  ④弃去PBS,加入3 mL培养液,用微量移液器轻轻吹打细胞制成细胞悬液。

 

  3细胞RNA提取

 

  应用RNAzol®RT RNA Isolation Reagent试剂盒提取细胞RNA,具体实验步骤如下:

 

  将异丙醇、无水乙醇、DEPC水放入4C冰箱中预冷,全程均在冰上操作;

 

  从培养箱中取出转染后细胞六孔板,弃去细胞培养液,用生理盐水冲洗2次,每孔加入1 mL的Trizol,反复吹打使细胞充分裂解,收集在1.5 mL的灭菌EP管中;

 

  在细胞裂解液中加入400µL的DEPC水,震荡混匀30 s,冰上静置10 min,4C,12000 r/min,离心15 min;

 

  取上清液至另外两个EP管中,加入等体积的异丙醇,轻轻混匀,冰上静置10 min,4C,10000 r/min,离心10 min;

 

  弃上清,余下沉淀中加入等体积的75%乙醇,混匀后4C,7500 r/min,离心5 min,此步骤重复一次;

 

  弃去乙醇自然风干后加入30µL的DEPC水溶解。

 

  4总RNA浓度和纯度测定

 

  1%琼脂糖凝胶电泳检测RNA浓度和纯度:总RNA与10Loading buffer按1:1的比例混合均匀,用10µL的微量加样器取混合液加入1%琼脂糖凝胶孔中,设置电泳电压110V,电泳时间10 min。凝胶成像分析实验结果,当出现三条或者两条亮带清晰明亮,且28 s亮度是18 s的1~2倍时,可逆转录为更稳定的cDNA用于后续实验。

 

  酶标仪测定RNA提取液在260 nm及280 nm波长处的OD值:取总RNA提取液2µL,用酶标仪检测OD260和OD280的比值,当比值在1.7~2.0时可用于后续实验(<1.7时表明有蛋白质和酚污染,>2.0时表明可能有异硫氰酸残留),根据吸光度值估算出各总RNA的浓度,为减少实验误差提取液应稀释到统一浓度且重复实验3遍。

 

  5总RNA逆转录为cDNA

 

  由于RNA易降解,需反转录为更稳定的形式cDNA用于后续实验。反应体系如下:

 

  Total RNA 8μL

 

  2.5u/μL polyA 1μL

 

  Rtase Mix 1μL

 

  5PAP/RT Buffer 5μL

 

  ddH2O 10μL25μL反应程序:37.0C 60 min

 

  85.0C 5 min

 

  4.0C保持6实时荧光定量PCR

 

  以稀释3倍体积的cDNA为模板,应用miR-198和内参U6引物相对定量qPCR法扩增miR-198和内参U6基因片段。每组细胞设3个复孔,实验重复3次。

 

  6.1反应体系如下:

 

  All-in-One qPCR Mix 5.0μL

 

  miRNA-198/U6 F+R(2.0μM)2.0μL

 

  cDNA模板1.0μL

 

  ddH2O(双蒸水)2.0μL10μL

 

  6.2反应条件如下

 

  95C(30 s)预变性

 

  95C(5 s)变性

 

  60C(20 s)退火45个循环

 

  72C(10 s)延伸

 

  72C(5 min)再延伸

 

  6.3实时荧光定量PCR结果分析方法

 

  反应结束后得到各个样品miR-198和内参U6的Ct值,根据公式计算目的基因相对含量:2-ΔΔCt,即为miR-198的相对表达量。每组细胞设3个复孔,实验重复3次。

 

  7统计学处理

 

  应用SPSS19.0统计软件进行统计分析,所得实验数据以均数±标准差(xs)的形式表示,多组间实验结果的比较采用完全随机设计的单因素方差分析,两组间实验数据的显著性分析采用t检验,当P<0.05时认为差异有统计学意义。

 

  结果

 

  1 miRNA-198在食管癌细胞株EC9706、Eca109中的表达分析

 

  qPCR检测结果显示(图1,表1):miRNA-198在食管癌细胞株EC9706和Eca109中的相对表达分别为:1790.04.58、156.74.51。miRNA-198在EC9706中的相对表达量明显高于在Eca109中的表达,差异有统计学意义(P<0.01)。

 

  图1 miRNA-198在食管癌细胞株EC9706和Eca109中的相对表达量

 

  注:*为EC9706与Eca109相比,P<0.01。

 

  表1 miRNA-198在食管癌细胞EC9706和Eca109中相对表达量的比较(xs)

 

  组别miR-198相对表达量食管癌细胞EC97061790.004.58*食管癌细胞Eca109156.674.51注:*为EC9706与Eca109相比,P<0.01。

 

  第二节miR-198对食管癌细胞增殖、凋亡、迁移等生物学特性的影响

 

  材料

 

  1实验分组

 

  miR-198转染食管癌细胞分为六组---50 nmol/L和100 nmol/L miR-198 mimics组,阴性对照negative control组(NC组,100 nmol/L),100 nmol/L和200 nmol/L miRNA-198 inhibitors组,未转染空白对照组。

 

  2主要试剂

 

  miR-198模拟物(mimics)、miR-198抑制物(inhibitor)购自上海吉玛制药技术有限公司;细胞培养板、转染试剂Lipofectamine2000购自Invitrogen公司;HyClone DMEM(高糖)培养基购自Gibco公司;Transwell小室购自美国Corning公司;四甲基偶氮唑蓝(MTT)购自碧云天生物技术研究所:二甲基亚砜(DMSO)购自美国Sigma公司;All-in-OneTMmiRNA qPCR Detection Kit、All-in-OneTMmiRNA First-Strand cDNA Synthesis Kit购自广州复能(GeneCopoeia)基因有限公司。

 

  3溶液配制

 

  转染试剂的配制:NC、miR-198 mimics、miR-198 inhibitor均需稀释成20µmoL/L的终浓度,0.5 OD的NC需加入62.5µL的DEPC水,1 OD的mimics需DEPC水125µL,1 OD的inhibitor中加入250µLDEPC水后混合均匀,-20C保存。

 

  MTT溶液:此法中的MTT浓度为0.2 mg/mL,称取3 mgMTT,加入到6 mL细胞培养基中,磁力搅拌至全部溶解,4C避光保存备用。

 

  4主要仪器

 

  高速低温台式离心机购自德国Eppendorf公司;荧光定量PCR仪购自美国Thermo公司;电子天平购自上海精天电子有限公司;微量加样器购自美国Eppendorf;超净工作台购自苏州净化设备有限公司;荧光显微镜及图像分析系统购自日本尼康ECLIPSE Ti-S公司;酶标仪购自Molecular Devices公司;xCELLigence DP系统、E-Plate 16细胞检测板购自艾森生物(杭州)有限公司。

 

  方法

 

  1 EC9706细胞培养与传代

 

  将人食管癌细胞EC9706接种于含有10%的胎牛血清(FCS)、100 U/mL青霉素、100µg/mL链霉素的HyClone DMEM(高糖)培养基于37C、5%CO2、饱和湿度下培养,根据细胞生长情况确定换液和传代时间,取对数生长期细胞用于后续试验。

 

  2细胞计数

 

  应用细胞计数板进行计数,步骤:取细胞计数板,盖上盖玻片,自血球计数盘chamber上方凹槽加入100μL细胞悬液,静置2 min,待细胞不流动后于100倍倒置显微镜下观察。计数四个大方格之细胞总数,再除4,最后乘以104,即为每mL中细胞悬浮液之细胞数。若细胞位于线上,只计下线与左线之细胞(或计上线与右线)。

 

  3细胞铺板

 

  超净工作台在实验前在紫外灯下照射30 min,并将完全培养基DMEM、胰酶、PBS置于37C水浴箱内加热;

 

  取对数生长期细胞EC9706,PBS冲洗3遍,加入1 mL胰酶,放入细胞培养箱中消化2 min,取出消化细胞倒置显微镜下观察细胞消化情况,若胞质回缩,细胞之间不再连接成片,表明此时细胞消化适中;

 

  弃去细胞消化液,加入完全培养基终止消化,800 r/min离心3 min,倒掉培养液,PBS冲洗3遍后加入3 mL完全培养基垂悬细胞;

 

  取100µL细胞悬液运用细胞计数板进行计数;

 

  在细胞悬液中加入完全培养基稀释到所需细胞密度后铺板。在细胞铺板时切忌将细胞悬液混合均匀,以防出现各孔密度不均的情况;

 

  待细胞铺板24 h后,细胞完全贴壁,进行细胞转染。

 

  4细胞转染

 

  本论文应用miR-198模拟物(mimics)、miR-198抑制物(inhibitor)转染食管癌细胞EC9706以靶向改miR-198的表达。转染试剂选择Invitrogen公司的Lipofectamine2000,miRNA mimics是模拟生物体内源的miRNAs,运用化学合成的方法合成,能增强内源性miRNA的功能。而miRNA inhibitor是化学修饰的专门针对细胞中特异的靶miRNA的抑制剂。转染时将miR-198 mimics与inhibitor用无血清无双抗的DMEM培养基分别稀释,以每mL细胞培养液中加入转染试剂2.25µL为标准,取转染试剂加入稀释好的miR-198 mimics与inhibitor中,混匀,室温孵育20min后加入细胞培养板中,使miR-198 mimics与inhibitor的终浓度为50 nmol/L、100 nmol/L及100 nmol/L、200 nmol/L,转染后37C、5%CO2培养箱中培养6 h,应用荧光倒置显微镜观察结果,并根据以下公式计算转染效率:转染效率(%)=荧光染色细胞数/总细胞数×100%,细胞转染效率均达80%以上符合实验要求。细胞培养板放入培养箱中培养24 h、48 h或72 h后用于后续实验。

 

  5 qPCR检测转染细胞中miR-198的表达情况。

 

  采用qPCR法检测转染后各实验组细胞中miR-198的相对表达量。按照All-in-OneTM miRNA qPCR检测试剂盒说明书操作,分别收集转染48 h各实验组的食管癌细胞EC9706,提取细胞的总RNA(酶标仪测定总RNA浓度,纯度要求:1.7

 

  6 MTT实验法检测细胞增殖

 

  本研究应用MTT法检测转染后miR-198对各实验组食管癌细胞增值的影响。MTT法的原理为:活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒并沉积在细胞中。四甲基偶氮唑盐(MTT)是一类水溶性物质,细胞存活时,MTT被细胞内的线粒体琥珀酸脱氢酶(NADH)变成一种紫色的不溶性结晶,析出的不溶性结晶物可以重新溶解于DMSO溶液。用酶标仪在490 nm处测定其吸光度值,在一定细胞范围内测得的吸光值与活细胞数目成正比。

 

  实验步骤具体如下:分别消化收集对数生长期EC9706细胞,以每孔6×103个细胞100μL/孔的量接种于96孔细胞培养板,每组3个复孔。转染24、48、72小时后倒掉培养基每孔加入MTT(0.5 g/L)95μL并继续孵育4 h后弃培养液,加入二甲基亚砜(DMSO)150μL/孔,振荡充分溶解,空白对照调零,酶标仪上测定490 nm波长处吸光度(OD)值,运用统计分析软件对比分析各组吸光度的差异。

 

  7平板克隆形成实验

 

  细胞接种存活率只表示接种细胞后贴壁的细胞数,但贴壁后的细胞不一定每个都能增殖和形成克隆。而形成克隆的细胞必为有增殖活力和贴壁的细胞。克隆形成率反映细胞增殖能力和群体依赖性两个重要特性。克隆形成率与接种密度有一定关系,做克隆形成率测定时,接种细胞一定要分散成单细胞悬液,直接接种在六孔板中,持续2~3周,随时检查,到细胞形成肉眼可见的克隆时终止培养。

 

  因此,本研究进行了平板克隆形成实验以进一步检测转染后miR-198对各实验组食管癌细胞增值的影响。实验步骤如下:

 

  EC9706细胞转染48 h后,取对数生长期的单层培养细胞,用0.25%胰蛋白酶消化并吹打成单个细胞,把细胞悬浮在10%胎牛血清、1%双抗的DMEM完全培养基备用;

 

  将细胞悬液作梯度倍数稀释,以200个细胞每孔的细胞密度(根据增殖能力而定)接种于含5 mL、37C预热培养液的六孔板中。轻轻转动,使细胞分散均匀。置37C 5%CO2及饱和湿度的环境下,静置培养2~3周(中间需换液时应换液);

 

  经常观察,当培养皿中出现肉眼可见的克隆时,终止培养。弃去上清液,用PBS小心浸洗2次。滴加瑞氏-姬姆萨A液0.5 mL与六孔板中,染色一分钟后再将瑞氏-姬姆萨B液1.5 mL滴加与A液上面,轻轻混匀后染色10 min。然后用流水缓慢洗去染色液,空气干燥;

 

  在显微镜(10低倍镜)计数大于10个细胞的克隆数。最后计算克隆形成率。克隆形成率=克隆数/接种细胞数×100%。

 

  平板克隆形成试验方法简单,试验成功的关键是细胞悬液的制备和接种密度,适用于贴壁生长的细胞,适宜底物为玻璃的、塑料瓶皿,且细胞一定要分散得好,不能有细胞团,接种密度不能过大。

 

  8流式细胞仪检测细胞凋亡率

 

  为检测转染后miR-198对各实验组食管癌细胞凋亡的影响,我们应用流式细胞术检测了细胞凋亡率。凋亡和程序性细胞死亡是一个重要的有效调节细胞生长和增殖的途径。细胞对特定的诱导信号作出反应后在细胞内发生一系列的变化,导致特征性生理改变。PS是一种正常情况下定位于细胞膜内侧的膜成分,Annexin V是一种Ca2+依赖的磷脂结合蛋白。在凋亡途径的早期,PS分子转移到膜的外侧后Annexin V可以与其结合。Guava Nexin分析法是利用Annexin V-PE检测凋亡细胞膜外侧的PS。非细胞通透性染料7-AAD在Guava Nexin分析法中用于检测细胞膜结构完整性。7-AAD排除了活细胞和早期凋亡细胞。在这一分析法中三类细胞被区分开来:

 

  正常细胞:Annexin V(-)/7-AAD(-)

 

  早期凋亡细胞:Annexin V(+)/7-AAD(-)

 

  晚期凋亡细胞:Annexin V(+)/7-AAD(+)

 

  Guava Nexin分析法只需要少于2104个的100µL的细胞液就可以进行读取。细胞在EP管中直接用Guava Nexin试剂染色,试剂为预先将Annexin V和7-AAD混合的溶液,反应终体积为200µL。室温孵育20分钟后,即可用Guava系统收集分析。

 

  细胞凋亡检测实验步骤:将转染后48 h的各组细胞用胰酶消化成单层细胞,300 r离心5 min;PBS洗涤细胞两次后细胞计数;取10104个细胞用含2%FBS的100µLPBS悬浮制成细胞悬液后加入100µLGuava Nexin试剂;室温孵育20 min后用guava easyCyte8设备收集样品。

 

  9 qPCR法检测凋亡相关基因Bcl2、Bax的相对表达量

 

  为进一步确定miR-198异常表达对食管癌凋亡的影响,本研究应用qPCR法检测凋亡相关基因Bcl2、Bax的在转染后食管癌细胞中的相对表达量。分别消化收集转染后各实验组的食管癌细胞EC9706,提取细胞的总RNA(运用酶标仪测定总RNA的浓度,纯度要求:1.7

 

  10 Transwell细胞迁移实验

 

  为检测转染后miR-198对各实验组食管癌细胞迁移能力的影响,我们进行了Transwell细胞迁移实验,检测不同实验组迁移细胞数的变化情况。

 

  (1)制备细胞悬液

 

  ①制备细胞悬液前撤血清饥饿24 h,进一步去除血清的影响;

 

  ②消化细胞,终止消化后离心弃去培养液,用PBS洗1~2遍,用无血清培养基重悬,调整细胞密度至6×105/mL。

 

  (2)接种细胞

 

  以每孔100μL 6×104个细胞量接种于Costar 24孔TranswellTM上室,在下室中加入600μL含10%胎牛血清的DMEM培养基,37C,5%CO2培养24 h。这里要特别注意的是,小室间和下层培养液常会产生气泡,一旦气泡产生,下层培养液的趋化作用就减弱甚至消失了,在种板的时候要特别留心,一旦出现气泡,要将小室提起,去除气泡,再将小室放进培养板。

 

  (3)细胞染色与计数

 

  用湿棉棒擦去小室内底部表面的细胞,0.1%结晶紫染色20 min,把Transwell小室反过来底朝上就可清楚看到小室底膜上下室侧附着的细胞。每孔选择9个视野用倒置显微镜(100倍)拍照并计数,计算每组小室细胞的平均数。

 

  11细胞划痕实验

 

  细胞划痕法是测定了肿瘤细胞的运动特性的方法之一。其借鉴体外细胞致伤愈合实验模型,在体外培养的单层细胞上,划痕致伤,然后加入药物观察其促进或抑制肿瘤细胞迁移的能力。

 

  因此,本研究进行了平板克隆形成实验以进一步检测转染后miR-198对各实验组食管癌细胞迁移能力的影响。实验步骤具体如下:

 

  实验时先用记号笔在24孔板背后,用直尺比着均匀的划横线,大约每隔0.5~1cm一道,横穿过孔。每孔至少穿过5条线。将处于对数生长期的EC9706细胞以每孔10×104个细胞接种至24孔细胞培养板,常规培养待细胞长成单层后弃去培养液,按实验设计分别转染细胞,24小时后用枪头比着直尺尽量垂直于背后的横线划痕,枪头要垂直,不能倾斜,不同孔之间最好使用同一只枪头,PBS洗细胞3次,去处划下的细胞,加入无血清培养基。放入37C 5%CO2培养箱中培养。分组处理0 h、12 h、24 h、48 h后观察细胞生长情况并在显微镜(×100)下拍照。用Image-proplus软件分别测量处理前和处理后的细胞划痕边界的距离,迁移距离=(0 h的边界距离-N h的边界距离)/2,计算并用统计软件分析。

 

  12 RTCA细胞迁移实验

 

  实时无标记细胞迁移技术(Real Time Cellular Analysis,RTCA)利用特殊工艺,将金微电极传感器阵列整合到细胞培养板的每个细胞生长孔底部,用以构建实时、动态、定量跟踪细胞形态和增殖分化改变的细胞阻抗检测传感器系统,当贴壁生长在微电极表面的细胞引起贴壁电极界面阻抗的改变时,这种改变与细胞的实时状态改变呈相关性,通过对阻抗值的实时检测从而获得与细胞生理功能相关的生物信息。为明确转染后miR-198对各实验组食管癌细胞迁移能力的影响,我们进行了RTCA细胞迁移实验,检测细胞迁移曲线,观察细胞在xCELLigence RTCA DP系统上的迁移过程。具体实验步骤如下:

 

  CIM Plate检测板装配及基线测定

 

  ①超净台内将CIM Plate检测板上室和下室从包装袋中取出,将CIM夹具放在超净台上,使蓝色标志点位于夹具的左上方,将下室平稳地放到夹具对应的凹槽中;

 

  ②下室的孔中加入165µL培养基(有孔为含血清培养基,有孔为无血清培养基),注意加液时不要产生气泡,使加入的培养基在下室的孔内形成凸出的弯月面;

 

  ③将夹具连同下室沿逆时针旋转90度,将上室中传感器一面置于下室上,注意使上室和下室的孔对齐。放置时注意上、下室贴有蓝点的孔相对应,放置时要避免气泡的产生。将上室放到下室上之后,立即用手向下按压,可听到两次卡扣卡入的声音;

 

  ④在上室中加入30µL无血清培养基,轻拍板四周,使培养基分布均匀。将device置于37˚C,CO2浓度为5%的CO2培养箱平衡1 h;

 

  ⑤基线测量:将平衡1 h的device置于RTCA DP Analyzer上,开始step 1进行基线检测。

 

  (2)细胞悬液准备

 

  细胞株在进行细胞迁移实验前一天进行细胞传代(需保证细胞状态良好,代数在20代之内)使在细胞实验时细胞满度在60~80%之间,从培养箱中取出细胞,进行消化,离心后,无血清培养基配制成实验需要的细胞浓度4105 cells/mL。

 

  (3)将细胞加入CIM板

 

  ①将测好基线的CIM板从DP上取出,在上室孔中加入100μL混合均匀的无血清细胞悬液,使每孔中细胞数目分别为4104;

 

  ②将CIM Plate板置于超净台中室温放置30 min;

 

  ③CIM Plate检测板放到培养箱中的RTCA Station上;

 

  ④在系统自动扫描“Scan Plate”后,开始Step 2,间隔10 min测量一次,共检测48 h。

 

  13统计学分析

 

  应用SPSS 19.0统计软件进行统计学分析,数据以均数±标准差(xs)的形式表示,采用完全随机设计的单因素方差分析,多个样本均数间的两两比较采用t检验。P<0.05为差异具有统计学意义。

 

  结果

 

  1 qPCR检测EC9706转染细胞中miR-198的表达情况:细胞转染效率均达80%的情况下,50 nmol/L、100 nmol/L mimics组miR-198相对表达量分别增加1789.33±6.03、2324.67±3.51倍;100 nmol/L、200 nmol/L inhibitor组miR-198相对表达量分别降低为0.36±0.01、0.14±0.02倍,阴性对照组EC9706细胞miR-198表达水平较空白对照组无明显改变,mimics、inhibitor组与阴性对照组相比差异有统计学意义(P<0.05)。各组相对表达量情况详见表2。

 

  表2不同实验组EC9706食管癌细胞miR-198的相对表达情况(x±s)

 

  组别miR-198相对表达量C1.010.02NC1.050.14198m-501789.336.03**198m-1002324.673.51**198i-1000.360.03*198i-2000.140.02*注:*与阴性对照组相比,P<0.05;**与阴性对照组相比,P<0.01。

 

  图2不同实验组EC9706食管癌细胞miR-198表达情况的比较

 

  注:*与阴性对照组相比,P<0.05;**与阴性对照组相比,P<0.01。

 

  2 MTT实验法检测转染后细胞的增殖情况:培养24、48、72 h mimics、inhibitor组及空白对照组与阴性对照组比较,食管癌细胞增殖无显著变化,结果无统计学意义(表3,图3)。

 

  表3不同实验组EC9706食管癌细胞在不同时间点下吸光度的比较(x±s)

 

  组别24 h48 h72 hC0.535±0.0240.769±0.0100.863±0.001NC0.551±0.0520.774±0.0010.878±0.019198m-500.568±0.0300.779±0.0210.867±0.032198m-1000.575±0.0200.732±0.0700.866±0.048198i-1000.562±0.0500.732±0.0520.858±0.008198i-2000.563±0.0010.735±0.0230.892±0.001

 

  图3不同实验组EC9706食管癌细胞在不同时间点下细胞增殖情况统计图

 

  3平板克隆形成实验检测细胞克隆形成率情况:培养2周后运用Giemsa染色,荧光倒置显微镜下计算克隆数并计算克隆形成率,(50 nmol/L、100 nmol/L)mimics、(100 nmol/L、200 nmol/L)inhibitor、空白对照组克隆形成率与NC组比较,细胞克隆形成率无显著变化。克隆形成率情况详见表4。

 

  表4 2周后不同实验组EC9706食管癌细胞克隆形成率的比较(x±s)

 

  组别克隆形成率C9.15%0.37%NC8.99%0.51%198m-5010.01%0.11%198m-10010.21%0.41%198i-1009.45%0.25%198i-20010.21%0.56%

 

  图4不同实验组EC9706食管癌细胞克隆形成情况统计图

 

  图5不同实验组EC9706食管癌细胞克隆形成图

 

  注:A:C组B:NC组C:50 nmol/L mimics组D:100 nmol/L mimics组

 

  E:100 nmol/L inhibitor组F:200 nmol/L inhibitor组

 

  4流式细胞仪检测不同实验组细胞凋亡的情况:转染48 h后mimics、inhibitor组及空白对照组与阴性对照组用guava Nexin进行染色。结果如图6所示,各实验组食管癌细胞凋亡未发生明显变化。这表明上调或下调miR-198的表达对食管癌细胞EC9706的凋亡无显著影响。

 

  图6不同实验组EC9706食管癌细胞凋亡检测

 

  注:A:C组B:NC组C:50 nmol/L mimics组D:100 nmol/L mimics组

 

  E:100 nmol/L inhibitor组F:200 nmol/L inhibitor组

 

  5 qPCR检测转染食管癌EC9706细胞中凋亡相关基因Bcl2和Bax的表达:如表5和图7所示,mimics、inhibitor组、空白对照组与阴性对照组相比细胞凋亡相关基因Bcl2和Bax差异无统计学意义(P>0.05)。

 

  表5不同实验组EC9706食管癌细胞Bcl2、Bax的相对表达情况(x±s)

 

  组别Bcl2相对表达量Bax相对表达量C1.10±0.041.03±0.05NC0.95±0.091.09±0.01198m-500.97±0.110.91±0.06198m-1001.01±0.030.97±0.02198i-1001.13±0.010.96±0.05198i-2000.99±0.080.98±0.07

 

  图7不同实验组EC9706食管癌细胞Bcl2和Bax表达情况的比较

 

  6 Transwell实验结果:(50 nmol/L、100 nmol/L)mimics、(100 nmol/L、200 nmol/L)inhibitor、NC及空白对照组中可见到的细胞数分别为(205.00±4.58)(281.67±3.06)(73.33±1.53)(65.33±2.08)(134.33±2.52)(132.67±2.08),mimics、inhibitor与NC组相比差异有统计学意义(P<0.01);NC与C细胞数差别不大(表6

 

  和图8)

 

  图8 Transwell实验结果

 

  注:A:C组B:NC组C:50 nmol/L mimics组D:100 nmol/L mimics组

 

  E:100 nmol/L inhibitor组F:200 nmol/L inhibitor组

 

  表6不同实验组EC9706食管癌细胞Transwell实验迁移细胞数(x±s)

 

  组别迁移细胞数C134.33±6.52NC132.67±7.08198m-50205.00±10.58198m-100281.67±9.06198i-10073.33±11.53198i-20065.33±5.08注:与阴性对照组比较,P<0.05;**与阴性对照组比较,P<0.01。

 

  图9不同实验组EC9706食管癌细胞Transwell实验迁移细胞数的比较

 

  注:*与阴性对照组比较,P<0.05;**与阴性对照组比较,P<0.01。

 

  7划痕实验结果:如表7和图10、11所示,50 nmol/L、100 nmol/L mimics组在12 h、24 h、48 h细胞迁移距离大于阴性对照组;100 nmol/L、200 nmol/L inhibitor组在12 h、24 h、48 h细胞迁移距离小于阴性对照组,差异有统计学意义(P<0.05);在不同时间点空白对照组与阴性对照组相比迁移距离无显著变化,差异无统计学意义。

 

  表7不同实验组EC9706食管癌细胞划痕实验迁移距离(µm)(x±s)

 

  组别0~12 h0~24 h0~48 hC129.17±0.11222.33±5.86336.83±2.52NC128.00±4.45223.67±5.69337.33±5.51198m-50139.33±2.08241.33±3.21#351.00±1.00$198m-100152.00±1.01254.67±3.21#371.67±5.69$198i-100111.00±2.04190.51±2.08#292.33±4.04$198i-200101.67±1.53172.00±5.57#275.33±2.52$注:为12 h时实验组细胞迁移距离与阴性对照组比较,P<0.01;#为24 h时实验组细胞迁移距离与阴性对照组比较,P<0.01;$为48 h时实验组细胞迁移距离与阴性对照组比较,P<0.01。

 

  图10不同实验组EC9706食管癌细胞划痕实验图

 

  注:A:C组B:NC组C:50 nmol/L mimics组D:100 nmol/L mimics组

 

  E:100 nmol/L inhibitor组F:200 nmol/L inhibitor组

 

  图11不同实验组EC9706食管癌细胞划痕实验迁移距离的比较

 

  注:为12 h时实验组细胞迁移距离与阴性对照组比较,P<0.01;#为24 h时实验组细胞迁移距离与阴性对照组比较,P<0.01;$为48 h时实验组细胞迁移距离与阴性对照组比较,P<0.01。

 

  8 RTCA实验结果:如图12所示,不同实验组细胞迁移曲线,其中横轴为时间,纵轴为细胞指数(Cell Index,CI值)。当下室有趋化因子时(10%FBS),细胞发生迁移,CI值在该实验中与细胞迁移数量成正比,细胞迁移数量越多,CI值越高。从图中可以看出,细胞经过十个小时左右开始迁移,mimics可以刺激细胞的迁移作用,并且高浓度的刺激作用稍强,具有一定的浓度依赖性,而inhibitor则出现相反的实验结果。

 

  图12不同实验组EC9706食管癌细胞迁移曲线

 

  第三节在食管癌细胞EC9706中过表达miRNA-198对靶基因PTEN的影响

 

  材料

 

  1细胞株人类食管鳞癌细胞(EC9706)购自中国科学院细胞库。

 

  2主要试剂

 

  PBS北京中杉生物技术有限公司

 

  PrimeScriptTMⅡ1st Strand cDNA Synthesis Kit TaKaRa

 

  Trizol Invitrogen公司

 

  氯仿上海宏瑞化工有限公司

 

  异丙醇上海宏瑞化工有限公司

 

  无水乙醇上海宏瑞化工有限公司DEPC武汉博士德生物工程有限公司EB武汉博士德生物工程有限公司琼脂糖Invitrogen公司

 

  50TAE(Tris-乙酸电泳缓冲液)北京索莱宝(Solarbio)科技有限公司

 

  3主要仪器

 

  高速低温台式离心机德国Eppendorf公司

 

  荧光定量PCR仪美国Thermo公司

 

  微量加样器Eppendorf

 

  生物净化工作台苏州净化设备有限公司

 

  CO2细胞培养箱美国Thermo公司

 

  倒置显微镜日本尼康ECLIPSE Ti-S公司

 

  酶标仪以及检测系统Molecular Devices公司

 

  荧光定量PCR仪(PIKOREAL 96 Real-Time PCR System)美国Thermo公司

 

  4主要试剂配制

 

  PBS缓冲液的配制(pH7.4):称取磷酸氢二钠2.9 g,磷酸二氢钾0.2 g,氯化钾0.2 g,氯化钠8.0 g,加入800 mL ddH2O中,混合均匀,使用实验是专用酸度计,盐酸调pH到7.4,再加ddH2O至1000 mL,高压蒸汽121C灭菌30 min,4C保存备用。DEPC水:DEPC与双蒸水按100μL:100 mL比例配制,振荡混匀,37C下保存12 h以上,121C高压灭菌30 min,4C保存备用。

 

  方法

 

  1 EC9706细胞培养

 

  人食管癌细胞EC9706培养基为含10%胎牛血清(FCS)、100 U/mL青霉素和100µg/mL链霉素的DMEM高糖培养基,培养条件为在37C、5%CO2、饱和湿度孵育箱中培养,根据细胞生长情况确定换液和传代时间,取对数生长期细胞用于后续试验。

 

  2细胞处理

 

  取传代至3~5代的对数生长期EC9706细胞接种于培养瓶中,待其融合约80%~90%时,运用胰酶消化,PBS冲洗3遍,加入完全培养基垂悬并吹打成单个均匀的细胞悬液后用细胞计数板计数,以每孔20104细胞量将细胞接种于六孔板中,培养24 h待细胞完全贴壁后进行转染。miR-198转染食管癌细胞分为四组---50 nmoL/L和100 nmoL/L miR-198 mimics组,阴性对照negative control组(NC组,100 nmoL/L),未转染空白对照组。转染用培养基采用不含血清和双抗的DMEM培养基,转染48 h后提取细胞总RNA用于后续实验。

 

  3 miRNA-198的靶基因生物学预测

 

  利用TargetScan、miRTarBase、Diana、Pictar四个miRNA靶基因预测数据库预测miRNA-198的靶基因,原则是找到与miRNA-198 seed region区互补配对的mRNA的3UTR区,对四种软件预测靶基因的交集进行功能分析,筛选出有意义的基因并进行进一步验证。其中PTEN、HMGA1、TCF21在前三个数据库中均有出现,PTEN是四个数据库的共同交集,选择四个数据库均预测的癌症相关基因PTEN为接下来要研究的miRNA-198可能成立的靶基因。

 

  4总RNA的提取

 

  异硫氰酸胍-酚-氯仿一步法提取RNA方法原理:

 

  TRIzol试剂中的主要成分为苯酚和异硫氰酸胍,其中异硫氰酸胍可裂解细胞,促使核蛋白体的解离,使RNA与蛋白质分离,并将RNA释放到溶液中。酸性苯酚可促使RNA进入水相,当加入氯仿时,它可抽提酸性的苯酚,离心后可形成水相层和有机层,这样RNA与仍留在有机相中的蛋白质和DNA分离开。有机层(红色)主要为DNA和蛋白质,水相层(无色)主要为RNA。

 

  实验步骤:

 

  取转染后48 h的EC9706细胞培养板于超净工作台中,弃培养液,PBS冲洗3遍后加入1 mLTRIzol进行裂解,室温静置5 min,反复吹打后将裂解液置于EP管中;

 

  加新开瓶的氯仿200µL(20%TRIzol量),上下颠倒混匀15 s(勿剧烈蜗旋),室温静置2~3 min,12000 r/min,4C离心15 min;

 

  小心吸取上清移至一个新的1.5 mL的EP管中(约600µL,宁可少吸不可多吸,以防污染),加入等体积的异丙醇,颠倒混匀,室温静置10 min,12000 r/min,4C离心10 min;

 

  弃上清液,干燥后每个EP管中加入500µL的75%的乙醇(无水乙醇中加入1/4体积的DEPC水),震荡摇匀,充分洗涤沉淀,12000 r,4C离心5 min,重复此步骤一次;

 

  弃上清液使沉淀自然风干后,加入30µL DEPC水溶解沉淀。微量加样器吸取提取的RNA 2μL,用酶标仪测定OD260和OD280比值检测RNA质量并计算出RNA浓度,比值位于1.7~2.0时RNA纯度符合实验要求。

 

  5 RNA的逆转录

 

  cDNA即与mRNA互补的单链DNA,即complementary DNA之缩写。cDNA以RNA为模板,在F、R适当引物及逆转录酶的作用下合成。与原来的基因组DNA相比不同之处在于无内含子,相比RNA来说更易于保存不易降解。

 

  PCR管中配制下列混合液,总量20μL。

 

  Total RNA8μLOligo(dT)18 Primer(50μM)2μLdNTP Mix2μLRNase free ddH2O8μL20μL

 

  65C保温5 min;冰上冷却。

 

  离心机上离心5 s,使混合物全部聚集于PCR管底部,重新放回冰上;

 

  在上述PCR管中配制下列逆转录反应液。

 

  上述模板混合溶液20μL5×PrimeScript Buffer8μLRNase inhibitor1μLPrimeScriptⅡRTase2μLRNase free ddH2O9μL40μL42C保温60 min;

 

  70C保温5 min后冰上冷却,-20C保存。

 

  6实时荧光定量PCR

 

  6.1 PCR反应液按下列组份配制

 

  SYBR5.0μLPTEN F+R(20μM)0.4μLcDNA模板0.3μLddH2O(灭菌蒸馏水)4.4μL10μL6.2进行qPCR反应

 

  预变性:95C-------30 s

 

  变性:95C------5 s

 

  退火:60C------30 s 50 cycles

 

  延伸:60C------30 s

 

  后延伸:20C------10 s

 

  6.3实时荧光定量PCR结果分析方法

 

  qPCR反应以GAPDH为内参基因,根据荧光强度达到最大时的Ct值,运用公式2-ΔΔCt计算目的基因PTEN的相对表达量。每组细胞设3个复孔,实验重复3次

 

  7统计学处理

 

  所得实验结果以均数±标准差(xs)的形式表示,两组间数据的显著性比较采用方差分析,数据差异性分析采用SPSS19.0统计软件完成,当P<0.05时认为差异有统计学意义。

 

  结果

 

  1 miRNA-198的靶基因生物信息学预测

 

  利用TargetScan、miRTarBase、Diana、Pictar四个miRNA靶基因预测数据库预测miRNA-198的靶基因,选择四个数据库均预测的癌症相关基因PTEN为接下来要研究的miRNA-198可能的靶基因。详见图13。

 

  图13 PTEN靶基因预测简况图

 

  2 qPCR检测EC9706转染细胞中PTEN的表达情况:细胞转染效率均达80%的情况下,50 nmol/L、100 nmol/L mimics组PTEN相对表达量分别降低0.5560.020、0.3960.012倍;阴性对照组EC9706细胞PTEN表达水平较空白对照组无明显改变,mimics与阴性对照组相比差异有统计学意义(P<0.01)。各组相对表达量情况详见表8。

 

  图14 PTEN在不同实验组食管癌细胞EC9706中的相对表达量

 

  注:与阴性对照组的比较代表P<0.01。

 

  表8 PTEN在不同实验组食管癌细胞EC9706中相对表达量的比较(xs)

 

  组别PTEN相对表达量C1.0440.049NC1.0370.101198m-500.5560.020*198m-1000.3960.012*注:与阴性对照组的比较代表P<0.01。

 

  讨论

 

  食管癌(Esophageal carcinoma,EC)是常见的恶性肿瘤之一,其发病率和死亡率都比较高,并且其是一种由多种因素引起,涉及多个基因、多条信号传导通路改变的一种异质性很强的恶性肿瘤,目前临床上缺乏有效的早期诊断方法。不同地区食管癌的发病率明显不同,中国北部地区为明显高发地带,发病率超过100/10000,而非洲西部发病率很低,不到5/10000,且男性发病率高于女性,在中国高发地区河南省食管癌是导致死亡的主要因素。由于早期诊断不典型、癌症病变的解剖部位特殊、起病隐匿,临床上缺乏有效的早期诊断方法等因素,且食管癌具有较强的侵袭转移能力,在早期就可以转移至周围淋巴结邻近的组织器官,导致大部分的食管癌患者确诊时已属于晚期。目前临床上针对食管癌的治疗方法包括外科手术、联合新药化疗、术前辅助放化疗、同期放化疗等。这些措施虽然增加了局部晚期食管癌的缓解率和肿瘤切除率,生存率亦有所提高,但预后仍很差;因此,阐明食管癌的发病机制、寻找更多低毒高效的特异性抗癌药对食管癌的早期诊断和有效防治具有十分重要的意义。近年来,随着分子药理学与功能基因组学研究越来越热门,一些功能性分子也越来越吸引人们的眼球,甚至有作为新型分子药物用于临床治疗肿瘤。例如,微小RNA,它已经被证实与很多肿瘤类型的发生发展存在密不可分的联系。自miRNA发现以来,越来越多的研究表明miRNA在食管癌的发生、发展及转移过程中起着重要作用。分析食管癌特异性miRNA的表达为建立食管癌早期筛查方法提供了新的契机。同时,结合miRNA的表达谱分析为患者提供个体化的治疗方案,在探索食管癌新的治疗方式上具有重要的意义。

 

  microRNA(miRNA)是一类长度很短的的非编码小分子单链RNA,主要在动物、植物、病毒和细菌的转录水平以及转录后水平,靶向一个或者多个mRNA,通过抑制翻译或降解靶标mRNA而调节基因表达。第一个被发现的miRNA是人们在研究lin-14基因在调节线虫发育中的作用时偶尔发现的,然而当时lin-4却被认为是线虫中特有现象被忽视,直到在线虫中发现第二个miRNA(let-7),它可以抑制多种在发育转型中发挥作用的基因翻译。这两个miRNA的发现引起了人们对小RNA研究的重视,随后更多的新的miRNA被发现并被深入研究,并研究出其各种生物学功能,例如短暂的生长发育调控、细胞增殖和死亡、造血功能和促肿瘤作用。miRNA在物种进化中相当保守,其具有明显的组织特异性和时序特异性,它的改变必将导致一些严重的病理过程。miRNAs参与细胞增殖和凋亡,在肿瘤的发生和发展中起着重要的作用,最近越来越多的证据表明,miRNA突变或者异位表达与包括恶性肿瘤在内的多种人类疾病有着密切的关系,miRNA可以起到肿瘤抑制基因或癌基因的功能。例如,let-7 miRNA在肺癌和结肠癌的研究中它可以负调控原癌基因Ras/let-60的表达水平从而发挥抑癌基因的作用;miRNA-206在乳腺癌的研究中扮演者抑癌基因的角色;miRNA-17-92基因簇在肿瘤的发展中起着癌基因的作用。相比于正常组织与癌旁组织,肿瘤中miRNA的表达水平出现明显改变,能明显上调表达或者下调表达。例如,miRNA-143和miRNA-145在鼻咽癌和卵巢癌中呈现低表达。XU等报道miRNA-145通过与其靶基因p30S6K1 3‵UTR结合抑制其转录,抑制miRNA-145表达可上调p30S6K1基因上游促血管生长因子(缺氧诱导因子1和血管内皮生长因子)的表达,从而促进卵巢癌生长和血管形成;在慢性淋巴细胞白血病的研究中发现miRNA-15a和miRNA-16a低表达,其靶基因Bcl-2蛋白水平随着miRNA的降低而升高,提高miRNA-15a和miRNA-16a的表达水平可以抑制淋巴瘤细胞的生长。到目前为止,miR-198低表达已经在很多癌症中被发现,例如前列腺癌、肝癌、肺癌、结肠癌以及胰腺癌,在眼癌和高分化的胰腺癌中miR-198被检测出高表达,但其与食管癌的关系尚未有具体研究涉及。

 

  近年来化学合成miRNA mimics和inhibitors是研究的一个新热点,已经成为研究动植物基因家族功能的有用工具,并有望成为临床研究和癌症治疗的一种新策略。miRNA mimics进一步增强内源miRNA的沉默作用,降低细胞内蛋白表达量,进行功能获得性(gain-of-function)研究;相反,使用化学合成的方法合成miRNA inhibitors,特异的靶向和敲除单个的miRNA分子,可以削弱内源miRNA的基因沉默效应,提高蛋白表达量,进行功能缺失性(loss-of-function)研究。我们运用化学合成的miRNA-198 mimic和inhibitor靶向改变miRNA-198的表达,探索miRNA-198对食管癌细胞生物学特性的影响及其与靶基因的作用。

 

  我们在前期研究中运用高通量miRNA芯片杂交技术发现miR-198与食管癌患者术后早期复发与预后密切相关。接下来我们筛选了稳定过表达miR-198的细胞株并通过靶向改变食管癌细胞miR-198的表达,探讨miR-198对食管癌细胞增殖、凋亡、迁移的影响,运用miRNA靶基因预测数据库预测miRNA-198的靶基因,并进一步探索了miR-198的改变与靶基因的相互作用。

 

  本研究运用qPCR的方法在不同的食管癌细胞株EC9706与Eca109中检测miR-198的表达,以期寻找到稳定的miR-198过表达株,实验结果显示miR-198在食管癌细胞株EC9706中的表达量明显高于Eca109,EC9706细胞株为高侵袭力低分化的食管癌细胞株,在EC9706食管癌细胞株中miRNA-198表达量明显升高,这与在组织中运用高通量miRNA芯片杂交技术所得结果一致,所以接下来我们选择EC9706为后续实验所需细胞株;通过在食管癌细胞株EC9706细胞中转染miR-198模拟物或抑制物的方法上调或下调miR-198的表达水平,观察其对食管癌细胞株EC9706细胞增值的影响。结果显示不同浓度的模拟物及抑制物转染EC9706细胞后在不同时间点增殖情况均未出现明显变化,我们大胆作出假设miRNA-198对食管癌细胞增殖无影响。为了进一步印证这一假设,我们运用平板克隆形成实验检测细胞克隆形成率,克隆形成率反映细胞群体依赖性和增殖能力两个重要性状,荧光倒置显微镜下计数各组克隆数,结果显示模拟物组、抑制物组克隆数与阴性对照组相比并没有发生显著性改变,这一结果更进一步说明miRNA-198对食管癌细胞增殖无影响这一假设的正确性。

 

  细胞凋亡普遍存在于生物界,既发生于生理状态下,也发生于病理状态下。由于细胞凋亡对组织内正常细胞群的稳定、胚胎发育及形态发生、疾病或中毒时引起的细胞损伤、老化、机体的防御和免疫反应、肿瘤的发生进展起着重要作用,并具有潜在的治疗意义,至今仍是生物医学研究的热点。细胞凋亡过少可引起疾病发生,在肿瘤的发生过程中,诱导凋亡的基因如p53等失活、突变,而抑制凋亡的基因如Bcl2、Bax等过度表达,都会引起细胞凋亡显著减少,在肿瘤发病学中具有重要意义,miRNA-198的改变是否会引起食管癌细胞EC9706凋亡率的改变呢?接下来我们运用流式细胞仪对不同实验组食管癌细胞的凋亡率进行检测,结果并不是我们所预想的那样,靶向改变miRNA-198的表达细胞凋亡率没有发生变化,这说明miRNA-198对食管癌细胞EC9706凋亡没有影响。为了进一步验证miRNA-198的改变不会对细胞凋亡产生影响这一结论的正确性,我们运用qPCR的方法检测了凋亡相关基因Bcl2、Bax的相对表达量,结果发现不同实验组食管癌细胞中凋亡相关基因Bcl2、Bax的相对表达量变化不大。miRNA-198对食管癌细胞增殖、凋亡均没有影响,食管癌预后差是否可能与食管癌细胞迁移相关呢?

 

  研究显示,miRNA在各种组织中的表达具有特异性,是组织分化程度的标志物,恶性肿瘤中某些miRNA的异常表达与癌细胞转移及不良预后有关。不同的肿瘤转移过程中出现不同特征的miRNA,因此可以用其表达谱来作为不同组织肿瘤转移的诊断和预后判断的标志物,该特征展示了miRNA在肿瘤转移临床治疗方面的巨大应用前景。然而,大量miRNA与特异肿瘤转移的关系及作用机制仍未阐明,有待人们进行深入研究。肿瘤的转移是一个多因素、多步骤、多环节参与的连续复杂过程。该过程主要包括肿瘤细胞从肿瘤的原发部位脱离,进入周围的基质、循环或淋巴系统,粘附在内皮细胞壁并向血管外迁移及在远处浸润、血管增生,形成新的转移灶。很多癌细胞具有变形运动能力,并且能产生酶类,使血管基底层和结缔组织穿孔,使它向其他组织迁移,这在癌症治疗中是很棘手的问题,使新的更灵敏的肿瘤标记物的发现显得更加刻不容缓。

 

  接下来我们运用转染miR-198模拟物及抑制物的食管癌EC9706细胞进行了Transwell实验,检测转染后miR-198对各实验组食管癌细胞迁移能力的影响,检测结果显示转染miR-198模拟物组穿过小室的细胞数明显增多,说明上调miR-198能够促进EC9706的迁移;转染miR-198抑制物与模拟物组结果相反,说明下调miR-198能够抑制EC9706的迁移,进一步证实了miR-198对食管癌细胞迁移的影响。

 

  为了更进一步阐明上调miR-198能够促进食管癌细胞迁移这一实验结果的正确性,随后我们运用转染miR-198模拟物及抑制物的食管癌EC9706细胞进行了划痕实验,结果显示转染miR-198模拟物组细胞迁移距离明显高于阴性对照组,抑制物组细胞迁移距离明显降低。

 

  实时无标记细胞迁移技术(Real Time Cellular Analysis,RTCA)利用对阻抗值的实时检测从而获得与细胞生理功能相关的生物信息。为明确转染后miR-198对各实验组食管癌细胞迁移能力的影响,我们进行了RTCA细胞迁移实验,当下室有趋化因子时(10%FBS),细胞发生迁移,CI值在该实验中与细胞迁移数量成正比,细胞迁移数量越多,CI值越高。从实验结果可以看出,上调miRNA-198的表达可以刺激细胞的迁移作用,且具有一定的浓度依赖性,高浓度的刺激作用稍强,而下调miRNA-198的表达则能够抑制细胞迁移。

 

  Transwell、细胞划痕实验及RTCA细胞迁移实验共同说明miR-198高表达能够促进食管癌细胞迁移,miR-198在食管癌转移的发生和发展中扮演着不可忽视的角色,有望作为与食管癌术后早期转移相关的一种生物标志物,这给miR-198异常表达食管癌患者早期诊断及转移预测带来了希望,使抑制肿瘤转移延长生存期变得可能。

 

  为了排除靶基因预测数据库预测中出现的假阳性结果,我们利用TargetScan、miRTarBase、Diana、Pictar四个miRNA靶基因预测数据库共同寻找miR-198的靶基因,四个数据库均预测PTEN为miR-198的靶基因。PTEN为常见的抑癌基因,PTEN基因编码的蛋白是具有双特异性磷酸酶活性的抑癌蛋白,在多种肿瘤中存在不同程度的突变、缺失、低表达、甲基化、磷酸化等形式,从而导致其抑癌功能减弱和丧失。PTEN在结直肠癌、子宫内膜样癌、膀胱移行细胞肿瘤、抑制肿瘤血管新生、白血病、宫颈腺癌、大肠癌等方面均有具体研究涉及,但在食管癌中还没有明确的说法。为了明确PTEN为miR-198靶基因这一假设,在食管癌细胞株EC9706中上调miR-198的相对表达量后,我们运用qPCR的方法检测了PTEN的相对表达量,结果显示上调miR-198的表达,PTEN的相对表达量出现明显降低,且随着miR-198表达量的升高PTEN的表达量随之降低。

 

  为了进一步证实PTEN是否为miR-198的靶基因,本课题组其他成员接下来将运用免疫印迹法测定蛋白表达量,希望从蛋白水平上证实这一说法的正确性;将利用新型MirTrap系统方法筛选鉴定miR-198作用的靶基因;报告实验验证miR-198对靶基因表达的调控作用;通过裸鼠移植瘤形成实验探索miR-198对肿瘤生长的促进或抑制作用。

 

  miR-198对食管癌细胞EC9706增殖、凋亡及迁移的影响及其对靶基因PTEN的作用,将为进一步研究miR-198的作用机制,以及用于食管癌患者的早期诊断、预后判断、靶基因治疗及临床治疗方案的选择等奠定了理论和实验基础。

 

  小结

 

  本研究第一节利用qPCR的方法检测了miRNA-198在不同食管癌细胞株中的表达,筛选出稳定过表达株,为后续实验奠定了实验基础。第二节通过在稳定过表达miRNA-198细胞株EC9706中转染mimics或inhibitor的方法上调或下调miRNA-198的表达,并利用qPCR的方法验证miRNA-198的表达水平,采用MTT法及平板克隆实验检测转染组细胞增殖能力,流式细胞仪检测细胞凋亡率,qPCR的方法检测凋亡相关基因Bcl2、Bax的变化,并利用Transwell、细胞划痕实验及RTCA细胞迁移实验共同检测上调或下调miRNA-198的表达水平对食管癌细胞株EC9706迁移能力的影响。第三节利用靶基因预测数据库miRTarBase、TargetScan、Diana、Pictar四个miRNA靶基因预测数据库预测miRNA-198的靶基因,并利用qPCR的方法检测靶向改变miRNA-198的表达水平后PTEN表达量的变化情况。研究结果表明:1)miR-198在EC9706细胞株中的表达水平明显高于Eca109细胞株,EC9706将为后续实验选定的稳定过表达细胞株。2)qPCR结果显示转染mimics或inhibitor后miRNA-198表达水平出现稳定上调或下调;上调或下调miR-198的表达能够促进或抑制EC9706细胞株的迁移但对增殖能力、细胞凋亡情况及凋亡相关基因均无影响。3)qPCR结果表明PTEN与miRNA-198的表达水平成负相关,初步断定PTEN即为miR-198在食管癌细胞株EC9706中的靶基因。

 

  综上,miRNA-198在食管癌细胞株中稳定高表达,这与高通量miRNA芯片杂交技术结果一致,miRNA-198高表达能够促进食管癌细胞株EC9706的迁移,并且能够导致靶基因PTEN这一抑癌基因表达水平的降低。提示食管癌预后差与miRNA-198过表达导致食管癌细胞迁移率升高及PTEN抑癌基因表达水平降低相关。这将为进一步研究食管癌患者的预后判断、分子分型、靶基因治疗及临床治疗方案的选择等临床转化研究奠定理论和实验基础,同时为寻找针对食管癌,特别是对早期食管癌特异性及敏感性都比较理想的肿瘤标志物带来了曙光。

 

  综述

 

  食管癌中microRNA作用研究进展

 

  摘要

 

  MicroRNA(miRNA)是一类具有在转录后水平调控基因表达功能的非编码小分子RNAs。研究已证实miRNA在肿瘤的发生和发展中起着癌基因或抑癌基因的作用,miRNA的表达谱可用于某些肿瘤的诊断、治疗和判断预后。本文就miRNA在食管腺癌和鳞癌中的异常调节,食管癌预后中miRNA的作用,以及食管癌中起致癌和抑癌作用的miRNA等方面研究进展进行综述。

 

  关键词MicroRNA,食管癌,食管腺癌,食管鳞癌,预后

 

  食管癌(Esophageal carcinoma,EC)是常见的消化道恶性肿瘤,占消化系统各部位肿瘤死亡的第二位,在全球恶性肿瘤病死率第6位,全世界每年死于此病达30万人。我国是食管癌发病率和死亡率最高的国家之一,占全球食管癌发病的50%以上,每年平均死亡约15万人。外科手术仍是食管癌最主要的治疗手段。尽管食管癌的诊断和治疗有了较大进展,但由于食管癌具有高度的侵袭性,治疗效果不理想,其5年生存率不到10%,死亡率仍无明显下降。早期诊断和治疗是决定食管癌患者治愈率及预后的一个关键因素。多个研究表明miRNA在多种肿瘤类型中表达异常,并与多种肿瘤的转移相关。例如miR-21、miR-192、miR-194、miR-106-25多顺反子(miR-25、miR-93和miR-106b)、miR-10b、miR-151和miR-93的高表达,以及miR-375、miR-203、miR-205、miR-145、miR-27b、miR-100、miR-125b、Let-7c等的低表达,这些miRNAs中大部分在其他癌症类型中异形增生,它们的靶基因在其它肿瘤中已经得到广泛的研究,miR-21和miR-375对于预后的独立性研究也已经多次被证实,但是miRNAs在食管癌不同癌变类型中的研究及把miRNAs作为早期诊断、预后和治疗反应的生物标记物等方面的研究还很少。在本文中,我们将总结microRNAs在食管癌中扮演的角色。

 

  1 microRNA的定义特点及其与肿瘤的作用

 

  microRNA(miRNA)是一大家族小分子非编码单链RNA,由一段具有发夹环结构,长度为70~90个碱基的单链RNA前体经Dicer酶剪切后形成的一段长度约20~25个碱基的RNA分子,其与其他蛋白质一起组成RNA诱导的沉默复合体(RISC)。miRNAs长度短小,有茎-环结构,数量比mRNA少,稳定性好,一个单一的miRNAs能够调节上百个基因表达。miRNAs通常靶向一个或者多个mRNA,通过抑制翻译或降解靶标mRNA而调节基因表达。在癌症中过表达的miRNAs,如miR-21和miR-17-92,它可能发挥致癌基因的作用,通过负调控抑癌基因而促进肿瘤的形成;但一些低表达的miRNAs,如Let-7则通过调控致癌基因而发挥肿瘤抑癌基因的作用。

 

  2 microRNA与食管癌

 

  食管癌变是多种因素综合作用,多基因变化先后积累或叠加形成的。研究证实,其发生与Rb、p53等抑癌基因失活,以及环境等多因素使原癌基因H-ra8、c-myc和hsl-1等激活有关。而miRNA作为继蛋白质之后又一高效的基因表达调控因子,并已证实在多种肿瘤的发生发展中有重要作用。

 

  2.1食管腺癌发展过程中调节异常的miRNAs

 

  研究表明,miR-192和-196a表达上调,以及miR-203表达下调与巴雷斯特食管症(Barett’s esophagus,BE)进展为食管腺癌(Esophagus adenous cancer,EAC)有关。与Barrett化生不同,miR-31在腺癌和高级别异型增生(High grade dysplasia,HGD)组织中的表达较明显下调,推断miR-31可能具有抑制食管腺癌发生的作用。Feber等人对比分析EAC和正常鳞状上皮(normal squamous epithelium,NSE)组织,发现13个miRNAs显著改变,除此之外,从NSE到BE再到EAC的恶性发展过程中miR-21、miR-194和miR-192是逐步调节的,这表明在BE恶性发展期间microRNA功能失调是早期发生的事情,因此对恶性发展的BE患者它可能成为有价值的生物标志物。杨等人通过非监督式分层聚类分析发现microRNA表达异常能清楚的将高级别异型增生(High grade dysplasia,HGD)和EAC从它们相应的配对NSE组织中分开。miR-106b-25的三个多顺反子(miRs-25、-93和-106 b)从NSE到BE再到EAC表达逐渐上调,miR-100、miR-125b、miR-205和miR-19b在EAC中显著抑制。有研究发现,miR-143、miR-145和miR-215的表达在EAC组织中比在BE组织中低,然而miR-203和miR-205的表达水平在BE和EAC组织中远远低于在NSE中。此外,从NSE到BE再到EAC miR-21表达有一个渐进增长的趋势。Mathe等人运用microRNA微阵列芯片技术在100对EAC/正常组织中描述microRNA,和正常组织相比miR-21、miR-223、miR-192和miR-194表达上调,miR-203表达下调。最近的分析研究表明,Fassan等人发现有13个microRNAs的连续信号与BE的发展相关,在BE的发展过程中有5个miRNA异形表达,包括高表达的miR-215和miR-192与低表达的miR-205、Let-7c和miR-203。Dijckmeester等人发现在BE中与在NSE中相比miR-143显著高表达miR-205显著低表达,这与数组分析结果一致。Luthra等人报道miR-196a在EAC中比在NSE组织中显著上调。Maru等人进一步表明miR-196a在组织学级别较高的表达逐渐增加,这表明miR-196a的改变在EAC的致癌作用中是一个早期事件。从以上异常表达的miRNA中得知许多microRNA在EAC的发病机理中成为重要的成员并可能成为EAC重要的生物标志物,独立的目标生物标记物可能提高从BE到EAC的发展预测,并且miRNA表达水平的检测有益于正常组织与食管腺癌组织的鉴别,还可预测BE患者病情的转归,作为BE患者高危预警、早期治疗的指标。

 

  2.2食管鳞癌发展过程中miRNA异常调节

 

  食管鳞癌(Esophageal squamous cell carcinoma,ESCC)在亚洲地区发病率较高,我国也是世界上食管鳞癌的高发区之一。据《现代食管外科》介绍,我国食管癌的发病人数占全球发病人数的60%之多。Guo等人报道ESCC与正常组织相比3个miRNAs(miR-25、miR-424和miR-151)被上调和4个miRNAs(miR-100、miR-99a、miR-29c、和mmu-miR-140*)被下调,miRNAs表达异常能区分食管癌组织与正常组织。Feber等人鉴别出在食管鳞状细胞癌中miR-21,miR-93和miR-342过表达,反之miR-203,miR-205,miR-27b,miR-100,miR-125b和Let-7c低表达。Lee等人发现在ESCC肿瘤组织中miRNAs let-7d、miR-330、miR-340和miR-373高表达了至少1.5倍,推测其可能具有促进鳞癌发生的可能性。Ogawa等人在30对ESCC组织和配对正常组织中运用qRT-PCR定量73个miRNAs的表达,21%的miRNAs表达上调了至少2倍,4个miRNAs下调了至少2倍。在Mathe等人的研究中,当miR-375表达降低时miR-21表达升高。Kano等人运用Taqman人类miRNAs基因数组法在ESCC组织中发现15个低表达的miRNAs可用于食管鳞癌诊断的分子标记物。最后,Hong等人在ESCC和正常食管癌组织中鉴定了12个miRNAs的表达,其中9个高表达(miR-155、miR-100、miR-146、miR-296、miR-10b、miR-203、miR-483、miR-494和miR-220),3个低表达(miR-143、miR-375和miR-339)。除了上述的性能分析研究外,在ESCC中还有一些miRNAs替代物的研究。Tian等人报道miR-10b在95%的食管鳞癌组织中高表达。miR-17-92在75%的食管鳞癌样本中高表达。miR-31在78%的ESCC组织中高表达。miR-29c表达水平在ESCC组织和细胞系中比在正常组织中显著低表达。在ESCC和细胞系中低表达,尤其在低分化肿瘤中,猜想miR-210的表达与分化程度有关。这些表达水平具有显著差异的miRNAs均可能参与食管鳞癌的发生发展,甚至可能成为食管鳞癌早期诊断和预后判断的分子标志物。但目前miRNAs在食管鳞癌中的研究并不多,仅少数研究涉及了miRNAs在食管鳞癌中的作用机制。

 

  2.3 miRNA对于EC预后的作用

 

  Ogawa等人在30例日本术后食管癌患者中发现miR-129高表达将死亡风险提高了18倍(P=0.031)。Mathe等人表示在70例ESCC患者非癌变组织中miR-21高表达与低生存率有关,在100例EAC患者中miR-375低表达与差预后有很大联系。miR-21对于预后的影响已经在其他两项ESCC淋巴结转移的研究中得到更进一步扩展。在ESCC中miR-375与低生存率成负相关,这一观点随后被Kong等人证实。

 

  其它一些miRNAs也被报道对于ESCC有预后价值,包括miR-143、miR-92a、miR-106和miR-148、miR-223、miR-142-3p和miR-133a。Kaplan-Meier分析显示miR-16-2和miR-30e的表达与所有EC患者的低生存率有关;除此之外,miR-16-2、miR-30e和miR-200a的表达与EAC患者的低生存率相关,但与ESCC患者无关。

 

  2.4食管癌中起致癌和抑癌作用的miRNAs

 

  食管癌被认为是一种复杂的基因病,食管癌的发生或发展过程中有癌基因的过表达和/或抑癌基因的表达缺失。下面我将对那些起抑癌和致癌作用的miRNA进行归纳总结。

 

  2.4.1起致癌作用的miRNAs

 

  miR-21

 

  在人类癌症中miR-21是最常见的表达上调的miRNAs,在EC、ESCC发展及ESCC预后中表现出高度一致性,miR-21调节很多参与细胞生存、凋亡和细胞侵袭性的基因,包括很多抑癌基因,例如TPM1、PTEN、乳腺丝抑蛋白、PDCD4。

 

  miR-106-25多顺反子

 

  miR-106-25多顺反子miRNA簇位于染色体7q22.1上,编码三个miRNA:miR-25、miR-93和miR-106b。miR-106-25从NSE到BE再到EAC中依次渐进地高表达。miR-106b-25多顺反子在体外和体内肿瘤形成过程中表现出潜在增殖、凋亡、细胞循环促进作用。miR-93和miR-106-b通过靶向肿瘤抑制基因p21降解靶基因mRNA,然而在EAC中miR-25的靶基因Bim(Bcl-2作为细胞死亡相互作用的中介)抑制翻译。

 

  miR-17-92多顺反子

 

  miR-17-92集群也被称为oncomir-1,是其中一个最具特色的致癌性microRNAs。这个基因位于染色体13q31.3上,编码6个人类miRNAs如miR-17、miR-18a、miR-19a、miR-20a、miR-19b-1和miR-92-1,并与大多癌症形成有联系。一项研究显示miR-17-92集群在ESCC肿瘤中过表达了75%。此外,在体内和体外高表达的miR-17-92能够促进肿瘤细胞的生长,miR-19a在体外诱导细胞凋亡,在体内损害肿瘤生长。

 

  miR-10b

 

  miR-10b在一些癌症类型中高表达其中包括ESCC。miR-10b被认为是第一个影响人类癌症(乳腺癌)入侵和转移的miRNAs。同样地,田等人在几个人ESCC细胞系中发现分子水平的miR-10b的表达水平与细胞的能动性和侵袭性相关。此外,KLF4被认定是miR-10b的直接靶基因,这个众所周知的抑癌基因据报道能够抑制食管癌细胞的迁移和侵袭。KLF4控制p21的表达水平而且介导p53依赖性G1/S细胞周期停滞来回应DNA损害。

 

  miR-196a

 

  miR-196a在几种类型的癌症和癌变前的食管组织中过表达。Luthra等人表明miR-196a的靶基因是ANXA1,在EC中这是一个细胞凋亡的关键中介,而且经常被抑制或丢失。Maru等人进一步鉴定了miR-196a额外的一些靶基因,其中包括KRT5、SPRR2C和S100A9,在BE的发展过程中这些基因全部低表达。

 

  2.4.2起抑癌作用的miRNA

 

  miR-375

 

  在EC中miR-375的前体通常高表达并且miR-375负性调节PDK1。在ESCC组织中还发现miR-375启动子频繁甲基化。在小鼠肿瘤形成和转移中miR-375抑制细胞聚集、细胞活性、细胞增殖。此外,miR-375能够与IGF1R的3'端非翻译区相互作用并且在体外抑制它的表达,临床样本中IGF1R与miR-375表达呈负相关。这些研究为通过启动子甲基化下调miR-375的表达提供了令人信服的证据支持。

 

  miR-205

 

  miR-205在许多不同的癌症中抑制免疫反应。Matsushima等人报道称在ESCC细胞中敲降miR-205的表达,在减少粘钙蛋白的同时大幅增加锌指E-box ZEB2的表达,表明在ESCC中miR-205通过靶向ZEB2达到EMT抑制来发挥肿瘤抑制作用。

 

  miR-145

 

  miR-145在许多癌症与癌变前组织中表达抑制。miR-145大量的目的基因已被实验证实。尤其是Sachdeva等人[63]证实c-Myc是miR-145的直接靶基因。另一方面,Kano等人发现miR-145一个新奇的目的基因FSCN1。FSCN1在ESCC中与正常组织相比高表达,而且FSCN1过表达与肿瘤的发展程度、淋巴结转移和差预后显著相关。在ESCC中这些数据表明FSCN1的抑制可能是miR-145抑癌机制中的一种。

 

  3循环miRNAs及食管癌

 

  循环改变的miRNAs表达谱潜在的说明机体生理和病理变化,有趣的是将循环miRNAs的鉴别作为以血液为基础的微创生物标志物用于早期癌症的治疗和预后,米切尔等人报道,组织派生的miRNAs在人类血浆中以一种非常稳定的形式存在,和其它类型的癌症相比,到目前为止系统的调查循环miRNAs在EC中很少有报道,在ESCC也很有限。张等人混合血清样品测序,在ESCC患者样本和正常组织之间检测25个候选miRNAs的差异表达,然后单独用qRT-PCR验证。7个血清miRNAs(miR-10a,miR-22,miR-100,miR-100-3-p,miR-133a,miR-148b,miR-223)被确认为ESCC的潜在生物标志物。通过比较肿瘤和邻近的正常组织以及病人和正常对照组血清样本之间miRNAs表达水平,中国的研究团队报道称在ESCC肿瘤组织和病人的血清样本中miR-31、miR-1322高表达。Komatsu等人将重心放在具有致癌作用的miR-21、miR-184和miR–221,对比分析ESCC患者血清与正常血清,具有肿瘤抑制作用的miR-375和确认的高表达miR-21以及低表达的miR-375进一步表明,等离子体水平的miR-21与miR-375的比率对于单独标记来说是一个更好的诊断标记。此外,日本团队评估了miR-21和miR-375对于预后的价值并报道,等离子体水平的miR-21复发的风险更高生存率更低,而高血浆水平miR-375则代表着更高的生存率。

 

  4 miRNAs在食管癌诊断治疗中的应用展望

 

  国内外研究表明,miRNAs表达谱对食管癌疾病的预测有一定作用,其中miRNAs表达谱在BE食管癌患者中的预测率达到77%,食管鳞癌的预测率可以达到82%。根据食管癌的miRNAs谱学研究结果,我们可以发现特异的miRNAs表达谱可以区分食管癌的肿瘤组织和癌旁组织,而不同病理类型的食管癌其miRNAs谱也是不同的,因此miRNAs的差异表达有助于食管癌的病理分型。

 

  实验表明,敲除或敲减肿瘤细胞中致癌性miRNAs以及在肿瘤细胞中引入抑癌的miRNAs可控制肿瘤细胞的生长。另外,通过设计与miRNAs互补的反义寡核苷酸(AMOs),与miRNAs结合,从而抑制某些致瘤miRNA的功能等技术也获得令人欣喜的效果。把miRNAs作为检测指标和治疗的靶点,为治疗肿瘤提供新的策略。

 

  5结语

 

  全球许多miRNAs表达分析研究已经在EAC和ESCC组织中进行。在EAC和ESCC的发病机理中miRNAs显然扮演了一个重要的角色。在EC中许多miRNAs一致特异表达基因已确定,包括上调基因miR-21、miR-192、miR-194、miR-194-25多顺反子(miR-25,miR-93和miR-106b)、miR-10b、miR-151和miR-93,下调基因miR-375、miR-203、miR-205、miR-145、miR-27b、miR-100、miR-125b和Let-7c等。这些miRNAs大部分在其他癌症类型中表达失调,他们的目的基因在不同的癌症基因中已经被广泛的研究。目标基因对于EC来说可能是特定的,miR-21和miR-375对于预后的价值已被重复地进行了独立性研究。在EC中循环miRNAs作为潜在的生物标记物用于早期诊断、预后和治疗反应几乎没有进行过研究。同样,在EC发生风险的背景下遗传变异miRNA的调控途径在很大程度上是一个未知的领域。毫无疑问,在未来几年里我们将看到循环miRNAs和基因变异探索大爆炸。未来应努力运用精心设计的大样本进行临床研究,统一处理方法来评估miRNA在EC预后中所起的作用。在EC中miRNAs的机制性研究有助于更好的理解发病机理、预后和识别EC潜在的药物靶位点。miRNAs在食管癌中未来的临床应用将是光明的。

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