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逼尿肌反射亢进大鼠膀胱ICC细胞兴奋性变化及意

发布时间:2015-10-08 14:01 作者: 来源:期刊论文投稿网

                                                                                  逼尿肌反射亢进大鼠膀胱ICC细胞兴奋性变化及意义 

 

                                                                       1张永革 1张伟 1何晓伟 1马文强 1吴永胜 1吴群 1李伟文 2方强 2宋波

                                                                         1解放军第一医院泌尿外科  2第三军医大学西南医院全军泌尿外科研究所

 

    [摘要]:目的: 观察脊髓损伤后大鼠逼尿肌反射亢进膀胱ICC细胞兴奋性的变化,探讨膀胱逼尿肌功能改变和ICC细胞兴奋性变化的可能关系。方法: 制作大鼠骶髓上损伤模型,膀胱压力测定证实膀胱出现逼尿肌反射亢进后,取膀胱组织急性分离ICC细胞,激光共聚焦显微镜观察ICC细胞兴奋性变化。结果: 逼尿肌反射亢进大鼠模型制作成功,膀胱ICC细胞兴奋性较正常组和膀胱造瘘组明显增加。结论: 脊髓损伤后大鼠膀胱功能改变可能与ICC细胞兴奋性增加有关。

[关键词]:脊髓损伤;逼尿肌反射亢进;ICC;兴奋性

 

The excitability change and significance of interstitial cells of Cajal in rat bladder with detrusor hyperreflexia

1ZHANG Yongge, 1ZHANG Wei, 1HE Xiaowei, 1MA Wenqiang, 1WU Yongsheng, 1WU Qun, 1LI Weiwen, 2FANG Qiang, 2SONG Bo

(1.Department of Urology, The First Hospital of PLA,Lanzhou 730030. 2.Institute of Urology, Southwest Hospital, the Third Military Medical University, Chongqing 400038,

 [Abstract] Objective: To investigate the excitability change of interstitial cells of Cajal ( ICC) in rat bladder with detrusor hyperreflexia after spinal cord injury. Methods: The rat model with suprasacral cord injury was made, and cystometry were conducted to confirm that bladder expressed detrusor hyperreflexia after spinal cord injury. The ICCs of bladder with detrusor hyperreflexia were freshly dispersed and the spontaneous calcium waves of ICCs were detected using laser confocal microscopy. Results: The model of rat with detrusor hyperreflexia was made successfully. The spongtanous excitability of ICCs in SSCI rats is higher than that in normal and post-cystostomy rats ( P < 0.05). Conclusion: It was possible that the functional change of bladder was due to the excitability change of interstitial cells of Cajal in rat after spinal cord injury.

  [Key words] Spinal cord injury; detrusor hyperreflexia; ICC

 

   脊髓损伤后膀胱逼尿肌反射亢进是临床最常见的神经原性膀胱功能障碍性疾病之一。Cajal间质细胞( interstitial cells of Cajal, ICC)是一种最早发现存在于胃肠道,起搏胃肠道慢波、传递电信号、介导肠神经与平滑肌之间信号调节的细胞[1]。近来的研究发现ICC细胞亦存在于动物泌尿道组织中并参与输尿管及尿道平滑肌的自发性收缩活动[2]。我们的前期研究发现大鼠膀胱中存在ICC细胞[3],且其具有自发性兴奋性,在逼尿肌反射亢进膀胱中其细胞数量明显增加[4]。本研究拟通过对比研究ICC细胞兴奋性在正常及逼尿肌反射亢进膀胱中的变化情况,初

 

步探讨其兴奋性变化与逼尿肌反射亢进发生的关系及意义。

材料和方法

1.1 实验动物及分组

  健康雌性清洁级SD大鼠60只,2-3月龄,体质量220~250g,购自第三军医大学实验动物中心。实验大鼠随机分为正常组、膀胱造瘘组和逼尿肌反射亢进组,每组20只。

1.2 主要试剂及仪器

恒温细胞培养箱(Heraeus公司),激光共聚焦显微镜(Leica公司),Ⅱ型胶原酶(Gibico公司),重组干细胞因子( SCF, Pepro Tech公司),Fluo-AM钙分析试剂盒(Invitrogen公司),羊抗鼠c-kit多克隆抗体( Santa Cruz公司),Alexa Fluor488驴抗羊二抗(Invitrogen公司),高糖DMEM培养基(Hyclone公司),标准胎牛血清(Hyclone公司) 。

1. 3  动物模型的制作及尿动力学检测

动物模型制作  健康雌性SD大鼠,1%戊巴比妥钠腹腔注射麻醉(40mg/kg)。膀胱造瘘:仰卧位固定,取下腹部正中切口,逐层切开显露膀胱,于膀胱侧壁插入直径为 1mm 末端带侧孔的硬膜外导管,荷包缝合固定于膀胱壁上。导管经皮下隧道自颈背部皮肤引出,妥善固定,逐层关腹。骶髓上损伤模型:俯卧位固定,根据浮肋连接的第13胸椎作为骨性标志来定位,骶髓上损伤的部位在脊髓胸10~腰2节段(对应脊柱的第8~12胸椎)。取背部正中切口,依次切开皮肤、皮下筋膜、向两侧钝性分离竖脊肌,破坏椎体,直至暴露脊髓并横断。

尿动力学检测  大鼠25%乌拉坦皮下注射麻醉(1g/kg),以硬膜外导管经尿道插入膀胱,膀胱造瘘大鼠可直接经造瘘管测压,导管或造瘘管经三通管与尿动力仪及微量灌注泵相连。轻压腹部,排空膀胱尿液,标定零点,用微量灌注泵将生理盐水0.2ml/min的速度灌注膀胱,同步记录膀胱充盈期间压力-容积变化曲线。

1. 4 膀胱ICC细胞的急性分离及免疫荧光鉴定

断颈处死动物后,取出膀胱,解剖显微镜下剔除黏膜层和浆膜层,剪成1×1×1mm3的小块,0.2%Ⅱ型胶原酶消化30~45min制成细胞悬液,以1×105/ml的密度接种于预先放入了圆形载玻片的六孔培养板中,并按照50ng/ml加入重组SCF,37℃、5%CO2培养箱中孵育贴壁8h。将贴壁的细胞片用4%多聚甲醛固定30 min,0.01 mol/L PBS漂洗3次,每次10 min,加入1:500稀释的羊抗大鼠c-kit多克隆抗体,4 ℃孵育过夜;0.01 mol/L PBS中漂洗5 min×3次;加入1:150兔抗羊二抗稀释液,37 ℃避光孵育1 h,0.01 mol/L PBS中漂洗3次;于DAPI染核10 min,0. 01 mol/L PBS中漂洗5 min×3次,激光共聚焦显微镜观察。

1. 5 Fluo-3荧光染色ICC细胞自发性钙波检测  

急性分离的细胞孵育贴壁后,Hank’s液漂洗3次,加入5 μmol/L 的Fluo-3 AM 37℃孵育30分钟,Hank’s液漂洗3次,室温继续孵育15-20分钟,加入0.5ml Hank’s液,激光共聚焦显微镜检测ICC细胞自发性钙波。

1.6细胞内游离钙检测原理

Fluo-3 AM是Ca2+荧光指示剂Fluo-3的亲脂性乙酰羟甲基衍生物。Fluo-3本身无法进入细胞,但它的亲脂性衍生物Fluo-3 AM可以透过细胞膜进入细胞。Fluo-3 AM无荧光,进入细胞后在胞浆酯酶作用下分解为Fluo-3,Fluo-3能与Ca2+结合,受波长为488nm的激光激发而产生荧光,其荧光值与[Ca2+]i呈正相关,即以荧光强度值变化表示[Ca2+]i变化。

1.7 结果分析

实验结果用均数±标准差(±S)表示,采用SPSS 13.0统计分析软件处理。多组均数间比较采用单因素方差分析,配对样本均数间比较采用配对t检验。结果以P<0.05为差异显著,P>0.05为差异不显著。

2  结果

2.1膀胱ICC细胞的急性分离及免疫荧光鉴定结果

膀胱ICC细胞分离后3小时可见细胞贴壁,8小时贴壁良好。培养8小时后,在相差显微下观察,ICC可表现出典型的细胞形态,胞体较小,有两个长的突起,多个短的侧突,与平滑肌有显著不同,从形态学上完全可以把二者区别开来(图1)。免疫荧光标记后在共聚焦显微镜下观察,可见ICC有长的突起,细胞核大,胞体小,胞质少,c-kit免疫荧光染色呈阳性(图2),平滑肌细胞胞体呈短棒状,无突起,c-kit免疫荧光染色呈阴性(图3).

图1培养8小时后膀胱ICC细胞(x200),细胞胞体较小,有两个长的突起,多个短的侧突(三角箭头所示),平滑肌细胞呈短棒状,无突起(箭头所示)。图2 培养8小时后ICC免疫荧光鉴定,c-kit染色呈阳性(绿色)。图3 培养8小时后平滑肌细胞免疫荧光鉴定,c-kit染色阴性。

2.2 膀胱ICC细胞具有自发性兴奋性

膀胱ICC细胞具有自发性兴奋性,激光共聚焦显微镜检测到其自发性荧光强度的变化(图4-7)。

图4  激光共聚焦显微镜下识别ICC细胞和平滑肌细胞(光镜照片):左侧多个突起为ICC,右侧梭形细胞为平滑肌细胞。图5  激光共聚焦显微镜下ICC细胞和平滑肌细胞(荧光照片)。

图6、7  ICC细胞Ca2+荧光强度出现自发性变化,平滑肌细胞Ca2+荧光强度无变化

 

2.3不同组间膀胱ICC细胞自发性钙波的幅度和频率变化(±S,n=20)

正常组                     膀胱造瘘组               逼尿肌反射亢进组

2.3.1不同组别膀胱ICC细胞自发性钙波幅度的比较

激光共聚焦显微镜检测结果显示,不同组间膀胱ICC细胞自发性钙波幅度差异,如表2-1所示。正常组和膀胱造瘘组ICC细胞自发性钙波的幅度无明显差异,正常组和膀胱造瘘组自发性钙波平均幅度分别为0.47±0.213和0.49±0.200,两者比较无明显差异(P>0.05);而骶髓上损伤组自发性钙波平均幅度为1.45±0.187,较正常组和膀胱造瘘组明显增高(P<0.05)。

表2-1  不同组间膀胱ICC细胞自发性钙波的幅度差异(F/F0,±S,n=20)

*P>0.05 vs 正常组;**P<0.05 vs 正常组和膀胱造瘘组。

2.3.2 不同组别膀胱ICC细胞自发性钙波频率的比较

激光共聚焦显微镜检测结果显示,不同组间膀胱ICC细胞自发性钙波频率差异,如表2-2所示。正常组和膀胱造瘘组ICC细胞自发性钙波的频率无明显差异,正常组和膀胱造瘘组自发性钙波平均幅度分别为0.20次/分和0.23次/分,两者比较无明显差异(P>0.05);而骶髓上损伤组自发性钙波平均频率为0.63次/分,较正常组和膀胱造瘘组明显增高(P<0.05)。

表2-2  不同组间膀胱ICC细胞自发性钙波频率差异(次/分,±S,n=20)

*P>0.05 vs 正常组;**P<0.05 vs 正常组和膀胱造瘘组。

 

3. 讨论

逼尿肌反射亢进是临床常见的神经原性膀胱功能障碍之一,目前临床上治疗方法较多,但效果都不是特别理想[5]。我们在章慧平[6]等方法的基础上,采用膀胱造瘘后脊髓T10~L2节段横断的方法,成功制作出满意的逼尿肌反射亢进动物模型,行膀胱造瘘的目的是避免梗阻因素对逼尿肌功能的影响。

ICC细胞是最早发现存在于胃肠道的一种间质细胞,其主要作用起搏胃肠道慢波,传递电信号和调节神经和平滑肌的关系。近年来研究发现,ICC普遍存在于各种器官,包括泌尿道的肾盂、输尿管和膀胱,但ICC细胞在泌尿道的作用还不清楚。研究发现,在先天性肾盂输尿管狭窄患者,肾盂输尿管连接部ICC细胞数量减少[7];在先天性巨结肠-巨膀胱-小肠蠕动失迟缓症患者,膀胱ICC细胞数量减少[8];膀胱在静息状态下记录到自发性期相性收缩,急性分离的膀胱ICC细胞也记录到自发性钙波[9],这些都提示ICC细胞可能在膀胱活动中起重要作用。

研究发现,ICC细胞为一种具有自发性兴奋性的细胞,有自发性节律性电活动,其静息膜电位(Resting potential, RP)为-60~-50mV,而平滑肌细胞的静息膜电位为-80~-70 mV,因此ICC比平滑肌细胞更容易被兴奋[10]。Shigeko等用激光共聚焦技术检测ICC细胞内自发性钙波,发现它们与细胞的电活动和慢波活动是一致的[11]。Johnston等用电压膜片钳技术记录ICC细胞瞬时内向电流和激光共聚焦显微镜检测细胞内自发性钙波变化,发现细胞内规律性的自发性钙波和自发性瞬时内向电流是一致的[12]。这些结果都提示可以通过检测ICC细胞内自发性钙波的变化来说明ICC细胞兴奋性的变化。

本实验用激光共聚焦的方法检测大鼠膀胱ICC细胞自发性钙波,发现不同组别大鼠膀胱ICC细胞在静息状态下都出现自发性钙波,正常大鼠和膀胱造瘘大鼠膀胱ICC细胞自发性钙波的幅度和频率无明显差异,而骶髓上损伤大鼠膀胱ICC细胞自发性钙波的幅度和频率要高于正常大鼠和膀胱造瘘大鼠。说明膀胱ICC细胞具有自发性兴奋性,且骶髓上损伤大鼠膀胱ICC的自发性兴奋性高于正常大鼠和膀胱造瘘大鼠,结果提示脊髓损伤后膀胱兴奋性改变可能与膀胱ICC细胞的兴奋性变化有关:骶髓上损伤膀胱ICC细胞兴奋性增强,可能参与了逼尿肌反射亢进发生。

    显然,单靠细胞兴奋性的变化就推断膀胱逼尿肌反射亢进是由ICC细胞的兴奋性变化引起的说法还不能成立,还需进一步的工作来证明这个推断,阻断ICC细胞观察膀胱功能的改变以及膀胱神经放电的变化可能是新的切入点。

 

参考文献

 

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2 McCloskey KD, Gurney AM. Kit positive cells in the guinea pig bladder[J]. The Journal of urology, 2002,168(2):832-836.

3 封建立,方强,丁砺蠡,等. ICCs细胞在正常大鼠膀胱中的分布及对逼尿肌收缩的影响. 第三军医大学学报. 2008,30(7): 558-560.

4 张永革,贾卓敏,方强,等. 逼尿肌反射亢进大鼠膀胱ICC细胞数量变化及意义. 临床泌尿外科杂志.2009,17(9):688-690

5   Verpoorten C, Buyse GM. The neurogenic bladder: medical treatment. Pediatric nephrology, 2008,23:717-725.

6   章慧平,陈忠,叶章群,等. 多节段脊髓平面损伤后大鼠神经源性膀胱模型的制备. 临床外科杂志. 2007, 15(3): 196-197.

7 Solari V, Piotrowska AP, Puri P. Altered expression of interstitial cells of Cajal in congenital ureteropelvic junction obstruction[J]. The Journal of urology, 2003,170(6 Pt 1):2420-2.

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9 Lang RJ, Hashitani H, Tonta MA, et al. Spontaneous electrical and Ca2+ signals in typical and atypical smooth muscle cells and interstitial cell of Cajal-like cells of mouse renal pelvis[J]. The Journal of physiology, 2007,583(3):1049-68.

10  Lang RJ, Zoltkowski BZ, Hammer JM, et al. Electrical characterization of interstitial cells of Cajal-like cells and smooth muscle cells isolated from the mouse ureteropelvic junction. The Journal of urology, 2007;177(4):1573-1580.

11 Shigeko Torihashi, Toyoshi Fujimoto, Claudia Trost, et al. Calcium oscillation linked to pacemaking of interstitial cells of Cajal. The Journal of Biochemistry, 2002;277(21): 19191-19197.

12  Johnston L, Sergeant GP, Hollywood MA, et al. Calcium oscillations in interstitial cells of the rabbit urethra. The Journal of physiology, 2005;565(2):449-461.

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