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羟乙基淀粉(HES130/0.4)对体外人肾小管上皮细胞

发布时间:2015-10-08 14:01 作者: 来源:期刊论文投稿网

                                                 羟乙基淀粉(HES130/0.4)对体外人肾小管上皮细胞HK-2共培养的影响

 

邵芹1  段满林2  李仁奇2  王琛1

【摘要】  目的  探讨羟乙基淀粉(HES130/0.4)对体外人肾小管上皮细胞HK-2的生长的抑制作用及其促凋亡作用。  方法  体外培养人肾小管上皮细HK-2,实验组分别加入含50%、25%、5%、2.5%不同浓度的羟乙基淀粉,对照组加入等量PBS培养液,采用四甲基偶氮唑蓝(MTT)比色法检测细胞1 d、3 d、5 d、7 d 存活率;流式细胞仪AV/PI双染色法50%、25%、5%共3组浓度羟乙基淀粉3 d、5 d、7 d对肾小管上皮细胞凋亡率的变化,过碘酸特殊染色观察羟乙基淀粉颗粒的沉积,透射电子显微镜观察其超微结构变化。  结果  当培养液中羟乙基淀粉浓度为50%5 d和7 d时,MTT法测得对肾小管上皮细胞的增生有显著的抑制作用,流式细胞仪检测细胞早期凋亡增加(P < 0.05),并具有时间-反应关系,过碘酸染色可观察到各组肾小管上皮细胞内的淀粉颗粒空泡和凋亡细胞,透射电镜可以观察到肾小管上皮细胞内的空泡和细胞凋亡的发生;羟乙基淀粉浓度为25%、5%、2.5%共3种浓度,作用1 d、3 d、5 d、7 d时对肾小管上皮细胞的增生(P < 0.01)的抑制作用与促凋亡作用,与对照组差异无统计学意义,但过碘酸染色可观察到25%肾小管上皮细胞内的淀粉颗粒空泡; 结论  高浓度与长时间的羟乙基淀粉与肾小管上皮细胞共培养引起肾小管上皮细胞凋亡和空泡化,可能是其损坏肾功能的机制之一。

【关键词】羟乙基淀粉;肾小管上皮细胞;细胞培养;凋亡

The effect of Hydroxyethyl Starches (HES 130/0.4) on incubation human renal kidney epithelial cells 

[Abstract] Objective To investigate the change in HES concentration induced human renal kidney epithelial cells injury. Methods Human renal kidney epithelial cells were exposed to 50%, 25%, 5%, 2.5%HES 130/0.4 for 7days, MTT assay was applied to detect cell viability. Flow cytometry was used to measure cell apoptosis incubated with 50%, 25%, 5% HES from 3-7 days. Periodic acid-Schiff (PAS) stained paraffin sections were used for light microscopy. Ultra-structural alterations were collected by transmission electron microscocpic (TEM). Results 50% HES decreased the human renal kidney epithelial cells viability in a dose- and time- dependent manner (P<0.05). The human renal kidney epithelial cells injury mainly in the form of apoptosis. HES was assumed to be present in mainly empty-appearing intracytoplasmic vacuoles on light and electron microscopy. Light microscopy and TEM obserbations indicate that the main human renal kidney epithelial cell death related with a specific feature of apoptosis, which had typical dense chromatin distributed along in the inner surface of the nuclear membrane. Conclusions This in vitro study shows that high dose HES induces tubular cells apoptosis and was assumed to be present in mainly empty-appearing intracytoplasmic vacuoles. We conclude that empty-appearing potentially provides a direct mechanism whereby can induce tubular atrophy and progressive renal failure.

 

[Key words] Hydroxyethyl Starches; human renal kidney epithelial cells; cell culture; apoptosis

                               

作者单位:1 苏州大学附属第二医院麻醉科 215004;2 南京军区南京总医院麻醉科 210002

通迅作者:王琛

羟乙基淀粉广泛应用于临床的胶体扩容剂,成功救治失血性休克和感染性休克等重症病人。国外多项研究和荟萃分析结果提示严重脓毒血症患者使用羟乙基淀粉类药品与晶体液相比较,死亡率和/或需要肾脏替代疗法的肾损伤风险增加[1-3]。但在我国收集到的羟乙基淀粉类药品不良反应报告中,未发现有明显的肾脏损害使用风险。本试验通过体外使用羟乙基淀粉超载时共培养肾小管近曲上皮细胞,探讨羟乙基淀粉是否对肾脏近曲小管上皮细胞有损害作用以及损害程度与浓度关系,为临床规范的应用羟乙基淀粉提供有价值的实验依据。

 

资料和方法

仪器与试剂  羟乙基淀粉130/0.4(万汶,批号:UH7301,Fresenius Kabi公司,德国),人近曲肾小管上皮细胞HKC(由南京军区南京总院肾脏病研究所提供);胰酶、新生牛血清、DMEM/F12培养基、戊二醛,MTT粉、过碘酸(均由杭州四季青公司提供);AV-FITC/PI双染流式细胞凋亡检测试剂盒(由深圳达可为公司提供Sigma);流式细胞仪由南京医科大学遗传学实验室提供,透射电镜(日立H600)由南京军区南京总院病理科提供。

人HK细胞株(近端肾小管上皮细胞)培养  细胞加入DMEM/F12+10%小牛血清中,常规传代培养。

MTT试验  体外培养人肾小管上皮细胞HK-2,实验组分别加入含50%、25%、5%、2.5%不同浓度的羟乙基淀粉,对照组加入等量PBS培养液,采用四甲基偶氮唑蓝(MTT)比色法检测细胞1 d、3 d、5 d、7 d 存活率。取对数期生长的细胞,经0.25%的胰酶消化,用培养液调至细胞数为2×105/ml,加至96孔细胞培养板,待细胞贴壁6 h后,轻轻吸去上清,用细胞培养液稀释四组羟乙基淀粉至50%、25%、5%、2.5%共4个浓度。每个浓度设7孔为试验孔,另设正常细胞对照4孔,空白组1孔。每天观察细胞的形态变化和生长情况,于培养后1~7 d分别加入MTT 20 μl,继续培养4 h,终止培养,去孔内液体,每孔加入150 μl DMSO,振荡10 min,使结晶充分溶解,选择570 nm波长,用酶标免疫测定仪测各孔光吸收A值代表细胞活性。细胞存活率=(实验组A值一本底A值)/(对照组A值一本底A值)×100%。实验重复3次。

流式细胞仪观察细胞凋亡  检测细胞凋亡情况,分别于加药50%、25%、5%后不同时相点(3、5、7 d)收集细胞,每组收集4瓶,1200 r/min离心5 min,弃去上清,用冷的PBS洗涤1次,计数板计数细胞后调整细胞数2×105,离心后重悬于500 μl黏合缓冲液中轻轻混匀后加入5 μl Annexin V(FITC)和5 μl PI(Propidium iodide),室温闭光孵育5 min,流式细胞仪进行检测(Ex=488 nm;Em=530 nm),分析细胞凋亡情况。结果判定:左下象限为正常细胞,右下象限为早期凋亡细胞,右上象限为晚期凋亡细胞,左上象限为死亡细胞。

病理学检测  特殊染色观察羟乙基淀粉颗粒的沉积。细胞爬片,过碘酸(PASperiodic acid-Schiff)染色,观察各组细胞内特殊染色的淀粉颗粒。电镜观察各组的凋亡情况,贴壁细胞消化、洗涤、离心、戊二醛固定,过夜。石蜡包埋,醋酸铀及柠檬酸铅电子染色,透射电镜照相、观察、切片。

统计分析  所有数据用均数±标准差(±s)表示,多组间比较采用one way ANOVA分析。所有检验用SPSS 13.0处理,P < 0.05为差异有统计学意义。

 

结  果

MTT结果  不同浓度作用下7 d内羟乙基淀粉对肾小管上皮细胞存活率的影响,结果显示,50%浓度组5 d和7 d细胞存活率较对照组低,差异有统计学意义。

流式细胞结果  对照组细胞状态良好,早期凋亡率为(6.73±1.5%),50%浓度组细胞早期凋亡率分别为(21.38±3.1%)、(32.45±2.8%)、(32.63±3.4%),早期凋亡率明显升高,P < 0.05,差异有统计学意义,其它浓度组与对照组比较早期凋亡无显著性差异(图1)。

特殊染色  过碘酸细胞爬片染色,在光镜下可以观察到25%、50%浓度组人肾小管上皮细胞HK-2内不着色的空泡,细胞凋亡(图2-4)。

电镜观察细胞凋亡  透射电镜观察结果显示,对照组细胞生长形态正常,羟乙基淀粉组细胞内出现空泡,以及凋亡的细胞和凋亡小体、细胞碎片。凋亡细胞中细胞核的形态表现典型,主要为核膜增厚,核染色质浓缩成团块,边集在核膜下,呈现半月形,部分可见核碎裂,核固缩。透射电镜下可见不同阶段的典型凋亡细胞,早期表现为染色质密集于核膜下,细胞核膜皱缩。晚期则核膜消失,染色体断裂为核碎片,并可见到凋亡小体(图5)。

讨  论

对羟乙基淀粉的认识经历了曲折的过程。曾经有研究认为万汶具有更低的分子量和取代级,扩容效果好,它的凝血、肾功能损伤的副作用小,许多研究证实其可以安全的用于心脏围手术期、老年患者、肾功能损害的病人,同时还具有抗炎作用[4]。而随着Blodt教授科研造假事件的发现,羟乙基淀粉的抗炎作用受到质疑。剔除教授的文章后的荟萃分析发现,羟乙基淀粉对于正常患者的肾功能没有影响[5],对肾功能不全的患者有肾功能损伤的严重副作用,增加危重患者和败血症患者肾功能衰竭的风险[1-3],所以潜在肾功能损害的病人避免使用,禁止用于无尿型肾衰。

本实验通过MTT法检测中低浓度的羟乙基淀粉与人肾小管上皮细胞HK-2共培养时并不影响细胞的存活率,而高浓度的羟乙基淀粉超载能导致近端肾小管细胞存活率降低。在MTT初步筛选药物浓度后,通过流式细胞仪检测羟乙基淀粉对肾小管上皮细胞的促凋亡作用,本试验通过体外细胞的研究,检测到高浓度长时间的羟乙基淀粉对人肾小管上皮细胞共培养时的早期凋亡,模拟潜在肾功能损害的病人羟乙基淀粉持续输注导致肾功能损害的过程,初步研究此种情况下肾功能损害与浓度时间的关系。An Deman等[6]的研究认为脑死亡的患者给予羟乙基淀粉维持血压时,并不影响其作为供体的肾脏的功能,指出与使用低于1500 ml的剂量有关,这也与本实验中的浓度对小管上皮细胞共培养时凋亡率起到决定作用的结论相一致。

本实验病理中可见:肾小管上皮细胞肿胀,胞浆内出现边界不清晰的巨大空泡变,推测认为,经肾小球滤过的羟乙基淀粉,在肾小管上皮细胞重吸收并逐渐积聚,诱导细胞凋亡,是肾小管损害的主要机制。这种空泡在Sirt C等的文章中也被提及,该文章通过免疫组织化学方法证实了细胞内的空泡即为羟乙基淀粉颗粒,在巨噬细胞等细胞内羟乙基淀粉的颗粒可以随着时间逐渐减少,但是消退的速度较慢[7]。当羟乙基淀粉的用量和时间有限,细胞凋亡率较低,细胞增殖和小管重建能够战胜凋亡,动物实验也证实羟乙基淀粉对健康兔的肾功能并无影响[8]。

人的近端肾小管上皮细胞株-HK2是稳定的传代细胞株,广泛用于科研中药物对肾小管上皮细胞直接毒性的研究。在离体实验中,无法研究到淀粉酶羟乙基淀粉代谢产物对肾脏的影响,以及肾脏血流量的变化,羟乙基淀粉对其它肾脏组织的影响,这是本实验的局限性。

综上所述,低于50%浓度的羟乙基淀粉与人肾小管上皮细胞HK-2共培养时并不影响细胞的存活率,但是会引起细胞的空泡化,而大于等于50%浓度的羟乙基淀粉共培养5天及以上能导致近端肾小管细胞凋亡。

参考文献

1.  Zarychanski R, Abou-Setta AM, Turgeon AF, et al. Association of Hydroxyethyl Starch Administration With Mortality and Acute Kidney injury in Critically ILL Patients Requiring Volume Resuscitation: A Systematic Review and Meta-Analysis. JAMA, 2013, 309(7): 678-688.

2.  Myburgh JA, Finfer S, Bellomo R, et al. Hydroxyethyl starch or saline for fluid resuscitation in intensive care. N Engl J Med, 2012, 367(20): 1901-1911.

3.  Haase N, Perner A, Hennings LI, et al. Hydroxyethyl starch 130/0.38-0.45 versus crystalloid or albumin in patients with sepsis: systematic review with meta-analysis and trial sequential analysis. BMJ, 2013, Feb 15; 346:f839.

4.  Wittlinger M, Schl?pfer M, De Conno E , et al. The effect of Hydroxyethyl Starches (HES 130/0.42 and HES 200/0.5) on activated renal tubular epithelial cells. Anesth Analg, 2010, 110(2): 531-540.

5.  Perel P, Roberts I, Ker K. Colloids versus crystalloids for fluid resuscitation in critically ill patients. Cochrane Database Syst Rev, 2013, Feb,28;2:CD000567.

6. Deman A1, Peeters P, Sennesael J. Hydroxyethyl Starch does not impair immediate renal function in kidney transplant recipients: a retrospective, multicentre analysis. Nephrol Dial Transplant, 1999, 14:1517-20.

7. Sirtl C, Laubenthal H, Zumtobel V, et al. Tissue deposits of hydroxyethyl starch (HES): dose-dependent and time-related. Br J Anaesth, 1999, 82(4): 510-515.

8. 袁福利,黑子清,陈秉学,等. 羟乙基淀粉和琥珀酰明胶急性高容血液稀释对兔肾脏的影响。中华麻醉学杂志, 2006, 26(8):760-762.

附  图

表1不同浓度羟乙基淀粉对人肾小管上皮细胞HK-2存活率的影响(%)

注:与对照组相比较,* P < 0.05

 

图1  流式细胞仪检测人肾小管上皮细胞HK-2凋亡情况

图2  25%浓度组羟乙基淀粉共培养人肾小管上皮细胞HK-2,可见细胞内空泡

 

 

 

 

图3  50%浓度羟乙基淀粉共培养人肾小管上皮细胞HK-2,可见细胞内空泡

 

图4  50%浓度羟乙基淀粉共培养人肾小管上皮细胞HK-2,可见凋亡细胞

 

 

 

 

图5  A、B、C均为50%浓度组羟乙基淀粉共培养人肾小管上皮细胞HK-2透射电镜图

图A可见细胞空泡化;图B可见早期凋亡,细胞核内细胞器边集;图C可见晚期凋亡,细胞核碎裂,细胞内凋亡小体形成。

 

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